睾丸生精细胞完全体外成熟培养的研究

维普资讯 http://www.cqvip.com 第２８卷第１４期　第三军医大学学报　Ｖｏ１．２８，Ｎｏ．１４　２００６年７月　ＡＣＴＡ　ＡＣＡＤＥＭＩＡＥ　ＭＥＤＩＣＩＮＡＥ　ＭＩＬＩＴＡＲＩＳ　ＴＥＲＴＩＡＥ　Ｊｕ１．２００６　１５３５　文章编号：１０００－５４０４（２００６）１４－１５３５－０４　键麓ｌ　＿＿ｌ　睾丸生精细胞完全体外成熟培养的研究　刘　锋，邹　彦，邓志华，檀大羡，丘　映，罗开玲　（广西医科大学第三附属医院生殖医疗中心，南宁５３００３１）　提要：目的在动物实验研究的基础上对人类睾丸生精细胞在体外培养分化、成熟进行初步探索，为临床治疗无　精子症奠定基础。方法将１４例患者的睾丸组织分离成生精细胞混悬液，采用生精细胞与支持细胞共培养或分选出初　级精母细胞和精子细胞培养，观察培养前后各级生精细胞的分化或成熟情况。结果１４例患者睾丸生精细胞经体外培养　后均有不同程度的分化和成熟。初级精母细胞能分化为精子细胞，分化率平均为４．５４％一６．５１％；Ｓａ期精子细胞能变形、　成熟为ｓｃ期精子细胞，成熟率为３．１３％～５．７４％。结论人类生精细胞经体外培养能进一步分化、成熟。初级精母细胞　能分化为早期精子细胞，ｓａ期精子细胞可变形为更成熟形式的Ｓｃ期精子细胞。甚至可以通过使用被拉长的精细胞或圆　形细胞进行显微受精，以达到妊娠的目的。　关键词：无精子症；生精细胞；体外培养　中图法分类号：Ｒ３２１．１；Ｒ３２２．６４；Ｒ３２９．２　文献标识码：Ａ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｅｓｔｉｃｌｅ　ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉａ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＬＩＵ　Ｆｅｎｇ，ＺＯＵ　Ｙａｎ，ＤＥＮＧ　Ｚｈｉ—ｈｕａ，ＴＡＮ　Ｄａ—ｘｉａｎ，ＱＩＵ　Ｙｉｎｇ，ＬＵＯ　Ｋａｉ—ｌｉｎｇ（Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｈｅ　Ｔｈｉｒｄ　Ｍ－　ｉｆｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｇｕａｎｇｘｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｎｉｎｇ　５３００３　１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅａｌＴｙ　ｏｕｔ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｕｈｕｒｅ　ａｎｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉａ　ｆｏｒ　ｔｒｅａｔｉｎｇ　ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ　ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ　ｉｎ　ｃｌｉｎｉｃ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｔｅｓｔｉｃｌｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｆｒｏｍ　１４　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗａｓ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉａ　ｃｅｌｌｓ　ｍｉｘｔｕｒｅ，ｃｏ—ｃｕｈｕｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｅｒｔｏｌｉ　ｃｅｌｌｓ，ｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｓｐｅｒｍａｔｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　ｓｐｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｏｕｔ　ｔｏ　ｃｏ—ｃｕｈｕｒｅ．Ｔｈｅ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｏｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｔａｇｅｓ　ｗａｓ　ｏｂ—　ｓｅｒｖｅｄ　ｂｅｆｏｒｅ　ａｎｄ　ａｆｔｅｒ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｕｈｕｒｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｍａｎｙ　ｄｅｇｒｅｅｓ　ａｆｔｅｒ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｕｈｕｒｅ．Ｐｒｉｍａｒｙ　ｓｐｅｒｍａｔｏｃｙｔｅｓ　ｃｏｕｌｄ　ｇｒｏｗ　ｉｎｔｏ　ｓｐｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ，ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ—　ｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ４．５４％ｔｏ　６．５ｌ％；Ｔｈｅ　ｓｐｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ　ａｔ　Ｓａ　ｓｔａｇｅ　ｃｏｕｌｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎｔｏ　ｓｐｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ，ｗｉｔｈ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　３．１　３％ｔｏ　５．７４％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｈｕｍａｎ　ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉａ　ｃａｎ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ　ａｎｄ　ｍａｔｕｒａｔｅ　ｄｕｒｉｎｇ　ｃｕｈｕｒｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．Ｐｒｉｍａ￣ｓｐｅｒｍａｔｏｃｙｔｅｓ　ｃａｎ　ｇｒｏｗ　ｉｎｔｏ　ｎｏｎａｇｅ　ｓｐｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ　ｓｐｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ　ａｔ　Ｓａ　ｓｔａｇｅ　ｃａｎ　ｍｅｔａｍｏｒｐｈｏｓｅ　ａｎｄ　ｍａｔｕｒｅ　ｉｎｔｏ　ｓｐｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ　ａｔ　Ｓｃ　ｓｔａｇｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ；ｓｐｅｒｍａｔｏｃｙｔｅ；ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｕｈｕｒｅ　在男性不育症中有１０％是由无精子症（ａｚｏｏｓｐｅｒ－　到成熟精子用于卵胞浆内单精子显微注射。１９９８年　ｍｉａ）引起的，无精子症分为精子通路梗阻或缺如导致　Ｔｅｓａｒｉｋ等…提出将无精子症患者睾丸内的生精细胞　的梗阻性无精子症（ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ　ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ，ＯＡ）和精　在体外培养到精子细胞成熟阶段或成熟的精子，再通　子发生障碍导致的非梗阻性无精子症（ｎｏｎｏｂｓｔｕｒｃｔｉｖｅ　过显微注射技术使其获得妊娠，为非梗阻性无精子症　ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ，ＮＯＡ）。梗阻性无精子症患者睾丸或附睾　患者的治疗提供了解决的途径。　内有成熟的精子，可应用卵胞浆内单精子显微注射　本研究通过ｌ４例无精子症患者的睾丸组织分离　（ｉｔｒｏｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｓｐｅｒｍ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ＩＣＳＩ），使其配偶妊娠　出生精细胞，在体外成熟培养、分化的过程进行初步探　而得到自己的后代。但是，有１％一２％的男性不育症　索，为临床上无精子症的治疗提供实验基础。尝试着　患者，在精子形成过程中发育到圆形精子细胞阶段即　将体外培养后获得的长形精子细胞行卵胞浆内显微注　终止进行，这些患者即使做睾丸切片取精往往也难找　射，结果１４　ｈ后观察出现受精的雌雄原核，３２—７２　ｈ　后分裂成８一ｌ６个细胞的早期胚胎。现将实验结果报　基金项目：广西壮族自治区科技厅资助项目（桂科基０１４１０１４），南宁市科技　告如下。　局资助项目（２００１ｌ３Ｄ）　Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｕｎｄｓ　ｂｙ　Ｓｃｉ＆Ｔｅｃｈ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｇｕａｎ－　１材料与方法　ｇｘｉ　Ｚｈｕａｎｇ　Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ　Ｒｅｇｉｏｎ（０１４１０１４）ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｕｎｄｓ　ｂｙ　Ｓｃｉ＆Ｔｅｃｈ　Ｂｕｒｅａｕ　ｏｆ　Ｎａｎｎｉｎｇ（２００１　１３Ｄ）　１．１　标本来源　作者简介：刘锋（１９５６一），女，山东省邹平县人，副主任技师，主要从事生殖医学　１４例前来接受生殖辅助治疗的无精子症的患者，这些患者　实验室方面的研究。电话：（０＂ｆ７１）４８２４３４６，Ｅ－Ⅱｍｄ：ｌ母啪０４＠１２６．ｅｏｎｌ　被允许进行附睾穿刺取精术，但未能获得成熟精子。从而在睾　收稿日期：２００５－０７－２８；修回日期：２００６・０５－ｌ１　维普资讯 http://www.cqvip.com １５３６　第　三　军　医　大　学　学　报　第２８卷　丸活检组织中获得未成熟的生精细胞。　１．２临床资料　本组１４例无精子症患者的年龄为（３２．７±１４．３）岁，不育　年限持续为（６．０±９．０）年，１４例患者的睾丸体积是（１７．１９±　６．８１）ｍｌ。１４例患者中，梗阻性无精子症的６例，非梗阻性无精　子症的８例。　１．３　实验方法　１．３．１　睾丸细胞的获取与制备　将睾丸活检出的数小片睾　丸组织置于一个含有１０％ＨＡＢ的Ｈｅｐｅ＋Ｅａｒｌｅｓ的（Ｆｌｅｃｏｎ　２００３）培养皿中。均采用酶消化法制备生精细胞混悬液，具体　操作如下：①在超净工作台上用机械分离的方法使组织在两块　玻片之间展开，紧接着将其反复抽吸入１支１　ｍｌ的结核菌素注　射器。除去体积比较大的组织碎片，用吸管反复吹打１～　２　ｍｉｎ，使精曲小管散开，再静置２～３　ｍｉｎ，使精曲小管下沉，弃　上清。加入相当于精曲小管１０倍体积的（１　ｍｓ／ｍ１）胶原酶Ⅳ，　在３２℃、１　ｍｓ／ｍｌ的胶原酶Ⅳ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｃ－５１３８，　Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中进行孵育３０　ｍｉｎ，从而将细胞团消化分散成单　个细胞。配制Ｐｅｒｃｏｌｌ梯度分离液２０％、３０％、４０％、５０％、６０％　共５种梯度液　，２　５００　ｒ／ｍｉｎ离心２５　ｍｉｎ，取３０％～４０％液面　的细胞混悬液。②将细胞混悬液移入１５　ｍｌ的Ｆｌｅｃｏｎ离心管　中，以２　５００　ｒ／ｍｉｎ离心５　ｍｉｎ，弃上清。在沉淀中加入含有　１０％ＨＡＢ的Ｈｅｐｅ＋Ｅａｒｌｅｓ培养液２—３　ｍｌ重悬细胞，再次　１　７００　ｒ／ｍｉｎ离心５　ｍｉｎ，弃上清后将细胞置于１　ｍｌ　ＨＴＦ　１０２０液　中５％ＣＯ　、３２　ｏＣ、湿度为９５％的培养箱中，备用。　１．３．２体外培养方案　１．３．２．１培养条件　在５％ＣＯ　、３２　ｏＣ、饱和湿度为９５％的　培养箱中培养，隔天换液１次。所有的细胞培养都是在　［Ｑｕｉｎｎ’ｓ　Ａｄｖａｎｌａｇｅ　Ｆｅｒｔｉｔｉｚａｔｉｏｎ（ＨＴＦ）Ｍｅｄｉｕｍ］Ｉ－ｒＦＦ１０２０改良　人输卵管液中，添加基因重组人ｒＦＳＨ（瑞士Ｓｅｒｎｏｏ）加入后最终　活力浓度分别为０、１０、２５、５０、１００　ＩＵ／Ｌ。另加入水溶性的无水睾　酮（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｃ－５０３５），最终浓度为１　Ｉ．￣ｍｏｌ／Ｌ。　１．３．２．２生精细胞的培养　采用微滴养，将ｒＦＳＨ和Ｔ配成　不同浓度的液体做上标志，并在Ｆｌｅｃｏｎ（２００３）培养皿中，做成　含量１５　ｌ的１Ｏ个微滴，每个相同激素浓度的微滴各为２个。　根据各病例睾丸组织分离获得的细胞情况采用下列两种培养　方法：①支持细胞与生精细胞（初级母细胞／圆形精子细胞）共　培养在检查生精细胞混悬液时含有支持细胞者采用此方法培　养。生精细胞混悬液置改良的人类输卵管液中培养。②生精　细胞分选培养有各级生精细胞存在的细胞混悬液中、支持细　胞少的病例中采用此方法，用显微分选法分选出少量初级精母　细胞和／或精子细胞，分别置于改良人类输卵管液中培养。　１．３．３观察项目和方法　１．３．３．１睾丸精细胞的形态鉴别　在睾丸组织样本中，通　过各种圆形精子细胞之间的差异来区别精细胞。在睾丸样本　中含有未分化的原始细胞与其他的圆形细胞如：精母细胞、精　原细胞、初级／次级精母细胞、红细胞、白细胞、单核细胞、淋巴　细胞是有区别的。精细胞虽小但稍大于红细胞，直径为８—　９　ｍ，有一个核，细胞质有规律地围绕在细胞核周围。在某些　圆形的精细胞中可见正在发育的顶体颗粒，犹如一个闪亮的斑　点与细胞核相邻。对于精母细胞，其核看起来比较平坦、细胞　质细腻，它们唯一有可能是大小尺寸上易与淋巴细胞相混淆，　因为淋巴细胞的核较大，从大小上不容易区别。初级精母细胞　比次级精母细胞大２倍。圆形精子细胞是无鞭毛的正圆形。但　是晚期或被变形的精细胞在近精子时期可见一个小小的鞭毛。　１．３．３．２　细胞涂片、ＨＥ染色　取部分细胞按常规方法涂　片、ＨＥ染色，在光镜下观察细胞的种类、形态特点等。　１．３．３．３生存活力检查　对用于细胞学分析的同一样本再　进行取样，用０．４％台盼蓝进行染色，检查细胞生存活力　（０．５　ｍｌ：Ｆ一８１５４，Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｌｅ，ＵＫ）。　１．３．３．４精子细胞体外培养的生长行为　每天在普通光学　倒置显微镜和／或微分干涉相差倒置显微镜下观察精子细胞培　养过程中的生长状态及形态变化。每隔３—５天用图像分析扫　描仪拍照。　１．３．３．５　精子细胞体外培养的成熟情况　每天在倒置显微　镜和／或微分干涉相差倒置显微镜下观察各组培养细胞的变化　情况。第１、２组随机选择数个视野，计数３００个细胞，分别记　录各组发育成熟的Ｓｃ期精子细胞数（个），计数３次，取其平均　值，并计算精子细胞体外成熟到Ｓｃ期精子细胞的百分率。实　验结果数据以（　±ｓ）％计算。　１．４统计学方法　采用ＳＰＳＳ　１０．０统计软件行方差分析。　２结果　２．１　体外培养前后生精细胞的鞭毛生长变化　在整个培养期间，初级精母细胞，延长的精母细胞和其他　非生精细胞的形态没有发生变化，然而，在生精细胞混合物的　体外培养中和分离的圆形精细胞部分的体外培养中约有２２％　的圆形精细胞显示出鞭毛的生长，除了鞭毛的生长外观察不到　圆形精子细胞的其他形态变化。在混合细胞悬浮液和分离的　圆形精细胞部分鞭毛生长的细胞，结果显示圆形精子细胞在培　养阶段早期就开始了其鞭毛的生长。在分离的圆形精细胞部　分中，４　ｈ后约８％的圆形精细胞已完成了鞭毛生长；８　ｈ后约　２２％的圆形精细胞显示出鞭毛生长，在随后的培养期间，显示　鞭毛生长的圆形细胞百分数几乎保持恒定，揭示了在体外培养　的最初８　ｈ圆形精子细胞完成鞭毛生长。　２．２体外培养前后生精细胞存活力评定实验　在体外培养期间，生精细胞的存活力只能保留较短的时　间，表１显示出混合悬液及分离纯化的细胞在体外培养前后的　４—７２　ｈ的生精细胞的存活力［（　４－ｓ）％］。结果表明，体外２４　ｈ开始，每组问细胞会逐渐丧失其存活力，此后细胞存活力逐渐　丧失，体外培养２４—４８　ｈ，大约有２０％的细胞丧失存活力。到　７２　ｈ，仅有４０％的细胞能排斥台盼蓝。在培养过程中我们观察　到，每个时间段，分选出的部分细胞存活力都显著高于混合细　胞悬液组，无论是梗阻性和非梗阻性或分泌性的无精子症患者　的睾丸组织获取的生精细胞体外培养结果都是十分相似的。　表１　体外培养后混合细胞和分离的纯化细胞的活力（％，ｊ　４－ｓ）　维普资讯 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　ＩＪ｜Ｌ　ｉｌｊ评等驰札　完　ｆ十　｝　蚺　ｆ１９Ｍ＇ｆｉ　选…１１：９　。ｌ圳胞。　卫特　恤Ｊ　＂；睦　ｆ　ｎ　Ｊ　５３７　ｒ　岫ｌ成熟半　２　３　仆卟培齐前后生精　Ｉ胞的　态　化　【【１　伽＿¨Ｉ　野　Ｌ　ｌ　Ｊ９　ｌ掩师Ｌ§７１，　Ｕ枢　七　Ｉ　ｒ　＾　删　｝　№　疗¨ｌ　Ｉ｝　似　十　川胞阶肛　晰ｒ　化　挑　圳Ｊ胆　蜘１　２７５　１　‘』　搿　Ｉ什精ＪＥ　ｆ＇３１［Ｔ　ｑ￣　城情坶　眦　佃Ｕ￣ｆｌＨｔ胞　ｒＫ掘　埘圳№搜矗　ｒ细忸．ｊ　巾剌垭批雌　枝龇赍￣ｌｌｔｌ　Ｊ－！．Ｊｉ｝本的１　址　岛Ｊ　矗ｌｌＪｌ愫ｌ　÷…　ｔ持　【№１Ｌ　川　ｆ址－能　精　帕件　Ｊ　摊　转¨昀情车蕞川　｝＊ｎ．　ｆ☆ｆｍ【　Ｈ廿　１　１　１☆　ｊ　５　Ｍ　Ｊ　ｉｌｉｌＪ１　０　｛　也　跳悬　ｊｉ仃Ｍ－珧　圳胞此炳削帕￡ｊ寸圳　ｌＬ转　．　２・　ｒ上　胞约ｔＩ　Ｉ３Ｓ￣，ｉ　乖川　Ⅲ　』￡Ｉ￣ｇｌ　ｒ性　良Ｌ墼辅　骨讯ｉ　ＪＩ￣Ｖ，　悱　精球４一ｊ』　『ｒｔ　驯精ｒ　…＆２２　，其一Ｉｉ　ｌ＿拈　圳桃Ｉ　’＿｝』』　忡蚓ｊ［＿＝ｎ　圳　　见ｊＩ　ｌ一　１　４　ＦＳＩ１寸精亍细胞成熟　鞋和精于斑生的影响　札子÷【Ⅱ№　ｆｔ　ｒ　｝¨　ｆ、ｌ　浓Ｊ　Ｉ】　』ｋ％ｌｆ　ｒ＇ｌ￣ＪＪ　　非ＩＩ小　２４　ｈ畸　”』　察．，＿ｌ【ｌ】Ｉ　Ｉ眯膻　ＨＩＩ　ｆＪ泄仃　韶　ｒ　ｌ『腿，１，　ｌ＿　＿｛￣ＩＩＩ／旧　慨ＦＳＩＩ　噎址２５＿ｌ　Ｉ　围Ｉ　目　闰４　期：　一　表２　体外培养　培养第１　级　母　胞硝　　ｉ　】后第３　处ｆ升　期　的　纽　母　后　４　后第　ｆ　的目　细胞ｒ　ｆｆｆｊ　Ｉ　ｒｉ　｛　纽　母　胞　ｆｍ　（　¨　ｍ１　５０Ｉ　Ｉ敞度　　帕　徙ｉＪｆｉｊ一　卅ｋ特　”耵　矗　虻　　ｆｌ：∞精ｒ圳眦ｌＬ削　Ｎ．Ｉ一　ｒｉｌｌＪ　仲．＝＝　精ｒｆｌｌＨＪｆＺ＇　Ｉ［３州仃ｍ良的恫』＿¨ｌ＇ｉｌ　ｌＪ　１１１１　ｈｌ＿Ｉ／Ｊ：限腰坪灌仃Ｊｆｆ　种敏　ｎ拧１、１　螗蚍之叫ｉ馒　俺州剥　…　』Ｊ『．　圳　＾２ｉｉＩＨ行剁仆　Ｌ　精ｒｆｌｉＦ　№悱　蚺　性坦　ｆ　Ｊ　Ｊ　ｌ　ｃ，　十　ｒ　ＩＩ】１Ⅱ　Ｉ　＿　ｉｆｌｌ『魁　戈｛　Ⅱ　Ｒ悼　，Ｉ　驯札ｆｒＩＩ舱ｎ　Ｊ世。　率Ｌ玑　』ｆ『眦Ｊ　一　冼ｉ　　ｒ　ｆＪ】　ｒ】　ｃ，　ｔｉｌ１１５一Ｉ　）　ｔｉＪ　　Ｊ｛　…　ｎ０（ＩＨ＾　１：，圩　：Ｆ￣ＩＩＩ惟的ｆ十　成热掘　虹　Ｊ　庠兼　ｓ　ｆ　胞百”辜　２　５　ＦＳＩｌ和Ｉ时精　蛔咆成熟分裂　精于览生的单独　醍复合澎响啦果　如１乔ｊ’ｊ体　州Ｉ【Ｉ＾Ｉ讯Ｉｌ　Ｊ　ｊ，Ｊ　Ｉ　Ｉ　ｐ．　ＩＩ刊牺于　№的脏　Ｌ讣　｛１　Ｊ　ｒ世　泄，Ｊ　牛ｆ［¨　响然…＿，１　Ｉ　ｌＩ　¨ＩＪ１［～卅　Ｊ　］Ｉ　１』¨蛳Ｊ　ＦＳＩＩ＾精于纠胞均腮搏舒　＊　ｎ“（　ｆｍＩ　～耻　【　Ｉ　１　』竹８　ｆ　情　…肛ｒｆ　－并级　ｊ帖ｆ　ｉｌｌ肌　卅ｆｌｌＩ地忠ｋｌ　，’ｌ　：　离　Ｉ非　搿牛精圳№！　ｎ　”＂２　｛，　１　Ｉ　ｌｉ，＇ｔ・艟硫将　丹精于　们州椎　Ｉ：ｊｆ￣　№？『　选…　计圳ｉｉＹｉ　ｉＪ【　ｔ盥Ｉｌ＇￣Ｊ～蛐　符液ｉ一』　柚于髓牛Ｄ　ｍｊ　ｎ…造种ＩＪｌｌ愠敏　ＩＢ　２４　ｈ　批稚件　蚌蚺　ｆ　择４一戢ｒ，７，　Ｉ刮　ｆ细ｒ心Ｊ∽１、　ｒ　，ｆ　千　…胞　（　１’ｉＪ　】ＩｔＩ　域情ｆ：　Ⅲ帆ｃ　　ｆ　～墩搬梢ＩＪ￣ＰＨ　ｒ崩Ｊ¨，化　ｌ幢　『　情　帆廿化斥ｒ　Ｊ｜ｊ　５１　ｒｆｌｌ［，ｑＥｆＪｌ肌　“叫　啦仃打世　』　ｎ　‘　｛０』卸川　．　热丰　ｒ均　５　７４％　＂　ｌ＿　川ｉ并　ｆ　ｔｉＪ＇　ｍ眦ｉｆ．　皓ｔ＆　『Ｈ拧１　２　ｐ『　法　』　Ｉ１　１¨ｆ』　￡　】Ｊ　；４８　１１“ｈ『　Ｉ川｝、ｌＩ　ＩＦ＇Ｉ　Ｊ］ｌｒ　口　砬　Ｔ　精于墼牛扪是蕾化｛ｉ　惮化ｎ咐ｉ　ｉｊ　噼　４ｄ２情ｒ　Ｉ抖常形　Ｉ于比俐晌　Ｊ。ｉＩＩｌ！￣Ⅲ　ＴＩｒｌ芹常　的　情Ｊ。　地“埔昨２４　Ｉ　ｔｆ　化枉瑚　１Ｈ　植删刊｛　坩￣ｉ２他　精　胞酌　…Ｊ４　：十　＇ｌｌＪ；　１９耷．Ｊ　他】　奇的　目　雇　ｌＩｉ￣Ｉｔ＋Ｉ对初敷　母　胞体＂培　丹　¨ｍ　Ｉ　Ｊ　ｔ｝　｝　ｔ０　０【　…】　４＊　１　¨Ｉ∞　Ｂ　ＴＩｌ￣ｔｉＭ１　｛Ｍ　ｆ　¨　㈨　“：ｋ　ｄ｝Ｉ）１．　…Ｉ　¨　２　６精碌　Ｊ他的卵臆浆内注射　｛　Ｊ　＃ｒ　７２　ｈ　ｎ　【　ｆ々　ｒ　Ｊ　Ｊ１１】０　ｕ－¨　哦ｌＫ　儿¨１　１、ｊ　０悼刊　Ｉ　５　帕ＩＩＩ¨ｌｌ　岸Ｉ　Ｅ　ｕ＿ｌｌ　Ｊ　ＩＪＩ　¨０　日ｎ】“ｆ｝址７　－Ｉｉ　Ｉ　ｆ　ｉｌｌｌ　ｌ¨；　或　瞳１＇１９￣ｉ｛］　…　～　书ＩＩ』　ＪＩ，ｉ￣ｉｉ成ＦＩ　始ＬＪ　仃自ｎ　｛Ｉｈ　之Ｊ　１　｝＾即　…　竹刑恺哑　Ｊｉ　ｌＩ他¨＿　化　Ｊ它们　ｆ　较Ｌ　ｆｌｌｌｌｆＪ￣　～　ｉ别『　”Ｊ　世地　秕　践　Ｉ］　Ｉ　｝　Ｊ１０　Ⅵ¨ｌＪＩ¨均ｔｉｌＩ．　川Ⅱ，似．Ｅ目十廿ｆ　，ｑ　］ＪＪＩ　　｝ｆ　ｆｌ】ｒｌ】竹ＨＩＩ＿Ｉ１１２６　Ｊ＾芥液舢舭　’ｌｉ　｛７　ｓ　¨ｌ　ｌ☆　硝　继续嘴年　１　１４　ｈ眦察　３，、ｌ　ｒｌＷ受　ｉｌ＇Ｃ　ｊｔ￣；ｌ　蚤特　ｉ６　ｈ　｛｝裂由４：＇ｐｔｌＪ　￣，３２　Ｊ　１　’；岫　ｉ　　Ｅ情　ｉ　Ｊｉ￣　ｌＪ讣　啦　～Ｉ“　Ｉｌ　Ｔ、ｌ　３讨论　庄几婪最甲州用精肌　胞他印子受牿戚功的址比　维普资讯 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１５３８　第　三　军　医　大　学　学　报　第２８卷　利时的Ｖａｎｄｅｒｚａｗｌｍｅｎ医生（１９９５）。同年Ｆｉｓｈｅｌ利用　长型精细胞使卵子受精怀孕成功。１９９６年，法国的　Ｔｅｓａｒｉｋ等　在全球首例报道利用圆形精子细胞使卵　子受精成功植回母体，并生下１对健康的女婴，使不孕　夫妇能拥有自己的基因的后代。这说明人类生精细胞　在体外培养能获得进一步的分化和成熟，为无精子症　和弱精子症患者的治疗提供了新的治疗手段。１９９８　年，Ａｓｌａｍ等　从梗阻性及非梗阻性无精子症患者睾　丸组织中分离出圆形精子细胞，培养４～８　ｈ后约有　２２％的圆形精子细胞出现鞭毛。Ｃｒｅｍａｄｅｓ等　将人　类圆形精子细胞与Ｖｅｒｏ细胞共培养，圆形精子细胞能　发育成长形精子细胞（Ｓｃ期精子细胞），甚至成熟的精　子。Ｔｅｓａｒｉｋ等　用阻滞于初级精母细胞阶段的生精　细胞经体外培养，使其从减数分裂阶段发育到精子细　胞变形阶段后，通过显微注射人其配偶的卵子内，获妊　娠成功，产下发育正常的双胞胎婴儿。Ｓｏｕｓａ等Ｈ　用　非梗阻性无精子症患者睾丸活检组织分离、纯化，获得　初级精母细胞与支持细胞，置于Ｖｅｒｏ细胞条件培养基　上共培养２～３周，结果初级精母细胞经减数分裂分化　成圆形精子细胞，其分化率为６．９％，而且这些圆形精　子细胞进一步发育成熟为具有正常形态的长形的精子　细胞。　在我们的研究中有６例是生精细胞发育在阻滞初　级精母细胞阶段，标本中无次级精母细胞及各种精母　细胞，经培养后初级精母细胞能分化为早期的精子细　胞。另８例标本在改良的人输卵管液中培养后，初级　精母细胞亦能分化为早期的精子细胞。表明在本研究　的条件下，人类生精细胞能够在体外培养并分化、成　熟，初级精母细胞的分化率为（６．５１±１．５６）％，但实　验结果与国外研究相比仍有一定差距。　在精子细胞的体外培养方面，Ｃｒｅｍａｄｅｓ等　用　Ｖｅｒｏ细胞作为饲养细胞培养人类精子细胞的成熟率　为１９％～４６％；Ｔｅｓａｒｉｋ等　研究组则为５１．１％；Ｓｏｕｓａ　研究组为２２．７％。本研究考虑到Ｖｅｒｏ细胞为异体的　非洲绿猴的肾上皮细胞，是否会对人的生精细胞带来　其他的病毒以及造成基因突变的原因不详故未采用。　而是采用精子细胞与支持细胞共培养以及细胞分选培　养两种方法，结果显示人类生精细胞经体外成熟培养　后，Ｓａ期精子细胞能进一步发育为更成熟形式的Ｓｅ　期精子细胞，精子细胞的成熟率为（５．７４±Ｉ．７７）％，　但精子细胞的成熟率及成熟程度低于国外研究组。　我们的研究结果表明，ＦＳＨ对抑制生精细胞的凋　亡（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）有关　，而睾酮可增强ＦＳＨ对生精细胞　凋亡的调控作用。在７２　ｈ体外培养的培养液中我们　加入不同剂量的ＦＳＨ，结果观察到在添加了２５～５０　ＩＵ／Ｌ含量的ＦＳＨ培养８～１６　ｈ后，部分圆形精子细胞　可镜下观察出现鞭毛，而１０　Ｉｕ或１００　ＩＵ的未见明显　的改变。当Ｔ和ＦＳＨ同时加入培养基时，Ｔ加强了　ＦＳＨ在精子细胞的成熟分裂和精子发生方面的作用，　这种加强效果在培养２４　ｈ后就能体现，而且可以延续　到培养４８　ｈ以后。Ｔ对ＦＳＨ的加强效果，Ｔ在精子发　生相关变化中的强化作用，可以从正常形态Ｓｄ２精子　和异常形态Ｓｃｐ精子比例的增加上反映出来，而异常　形态的Ｓｂｐ精子比例在培养２４　ｈ后仅表现出细微的　下降，其他形态的精子则没有检测到任何变化。这与　国外的研究结果是一致的。　本研究已经证实，使用早期（圆形）或晚期（长形　的或正在变长的）精子细胞进行卵胞浆内显微注射，　能使卵母细胞受精、卵裂。这一结果看来有望使无精　子症患者终能拥有自己传统基因的宝宝。但是这种技　术是否能将无精子症患者的某些遗传缺陷传给下一　代？尽管国外已有利用圆形精子细胞行卵胞浆内显微　注射后授精、卵裂、并妊娠生育健康婴儿的报道，但体　外培养过程中，生精细胞短时间内的减数分裂是否存　在着一些潜在的基因突变的因素呢？这一切尚是未知　数。必须要依靠胚胎种植前诊断技术（ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｉｏｎ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ＰＧＤ）才能最终解决问题。　参考文献：　［１］ＴＥＳＡＲＩＫ　Ｊ，ＧＲＥＣＯ　Ｅ，ＲＩＥＮＺＩ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｐｅｒｍａｔｏ－　ｇｅｎｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｉｎ－ｖｉｔｒｏ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ　ｂｉｏｐｓｙ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｆｒｏｍ　ｐａ－　ｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ　ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ：ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｒｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｆｏｌｌｉｃｌｅ　ｓｔｉｍｕ－　ｌａｔｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ［Ｊ］．Ｈｕｍ　Ｒｅｐｒｏｄ，１９９８，１３（１０）：２７７２—２７８１．　［２］ＧＡＮＤＩＮＩ　Ｌ，ＬＥＮＺＩ　Ａ，ＬＯＭＢＡＲＤＯ　Ｆ，ｅｔ　ａ１．Ｉｍｍａｔｕｒｅ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｍｏｄｉｉｆｅｄ　ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　Ｐｅｒｃｏｌｌ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｓｏｍｅｎ［Ｊ］．Ｈｕｍ　Ｒｅｐｒｏｄ，１９９９，１４（４）：１０２２—１０２７．　［３］ＴＥＳＡＲＩＫ　Ｊ，ＭＥＮＤＯＺＡ　Ｃ．Ｓｐｅｒｍａｔｉｄ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｉｎｔｏ　ｈｕｍａｎ　ｏｏｃｙｔｅｓ．　Ｉ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｉａｌ　ｆｅａｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ｚｙｇｏｔｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　［Ｊ］．Ｈｕｍ　Ｒｅｐｒｏｄ，１９９６，１１（４）：７７２—７７９．　［４］ＡＳＬＡＭ　Ｉ，ＲＯＢＩＮＳ　Ａ，ＤＯＷＥＬＬ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｏｆ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ｔｅｓｔｉｃｕｌｒａ　ｂｉｏｐｓｉｅｓ　ｏｆ　ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉｃ　ｍｅｎ［Ｊ］．Ｈｕｍ　Ｒｅｐｒｏｄ，１９９８，１３（３）：６３９—６４５．　［５］ＣＲＥＭＡＤＥＳ　Ｎ，ＢＥＲＮＡＢＥＵ　Ｒ，ＢＡＲＲＯＳ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎ－ｖｉｔｒｏ　ｍａｔｕｒａ．　ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｏｕｎｄ　ｓｐｅｒｍａｔｉｄｓ　ｕｓｉｎｇ　ＣＯ－ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｎ　Ｖｅｒｏ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｈｕｍ　Ｒｅ－　ｐｒｏｄ，１９９９，１４（５）：１２８７—１２９３．　［６］ＴＥＳＡＲＩＫ　Ｊ，ＢＡＨＣＥＣＩ　Ｍ，ＯＺＣＡＮ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆｆｅｒｔｉｌｉｔｙ　ｂｙ　ｉｎ－ｖｉｔｒｏ　ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ，１９９９，３５３（９１５２）：５５５—５５６．　［７］ＳＯＵＳＡ　Ｍ，ＣＲＥＭＡＤＥＳ　Ｎ，ＡＬＶＥＳ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｐｏｔｅｎｔｉｌａ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ＣＯ－ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｓｅｒｔｏｌｉ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｈｕｍ　Ｒｅｐｒｏｄ，２００２，１７（１）：１６１—１７２．　［８］ＴＥＳＡＲＩＫ　Ｊ，ＢＡＬＡＢＡＮ　Ｂ．Ｉｎ－ｖｉｔｒｏ　ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｒｅｓｕｍｐｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍｅｎ　ｗｉｔｈ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ａｒｒｅｓｔ：ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｗｉｔｈ　ｉｎ・ｖｉｖｏ　ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｓｔａｇｅ　ａｎｄ￣，ｅｒｏ　ａｍ　ＦＳＨ［Ｊ］．Ｈｕｍ　Ｒｅｐｒｏｄ，２０００，１５（６）：１３５０—１３５４．　（编辑王红）