为研究
徐雪峰;沈爱金;郭志谋;梁鑫淼
【摘 要】基于巯基硅胶与单取代-6A-烯丙氨基-β-环糊精的巯基-烯点击化学反应,制备了β-环糊精(Click TE-CD)共价键合固定相.元素分析结果表明β-环糊精被成功键合到硅胶表面.以黄酮苷类化合物为模型,考察了Click TE-CD固定相在亲水、反相和超临界流体色谱等分离模式下的色谱保留行为.黄酮苷类化合物保留时间随流动相中乙腈含量的变化呈现典型的U型曲线,表明Click TE-CD固定相具有亲水/反相的双重保留特性.应用几何学方法测得Click TE-CD固定相在反相/亲水、亲水/超临界、反相/超临界混合模式下的正交性分别为69.8％、50.8％、50.8％.对比复杂中药样品降香提取物在反相、亲水、超临界等模式下的分离情况,结果表明Click TE-CD固定相在分离中药复杂样品方面具有极大潜力,可以在一根色谱柱上通过分离模式的改变,实现二维液相色谱的分离.Click TE-CD固定相不同分离模式的分离性能和较好的正交性表明该固定相具有在液相色谱方法发展和二维液相色谱分离方面应用的潜力.%A native β-cyclodextrin (β-CD) stationary phase was prepared by covalent bonding of β-CD on silica particles via thiol-ene click chemistry. The resulting β-CD bonded silica (Click TE-CD) was characterized by elemental analysis, which proved the successful
immobilization of β-CD on the silica support with thiol-ene click chemistry. Click TE-CD was chromatographically evaluated with a set of flavone glycosides under hydrophilic interaction chromatography (HILIC) mode, reversed-phase chromatography (RPLC) mode and supercritical fluid chromatography (SFC) mode. The acetonitrile content dependent \"U\"
retention curves indicated its HILIC/RPLC mixed-mode retention behavior. The difference of the separation selectivity between HILIC, RPLC and SFC was described as orthogonality by using geometric approach. The orthogonalities between HILIC/RPLC, HILIC/SFC, and RPLC/SFC reached 69.8%, 50.8% and 50.8%, respectively. The separation of Chinese traditional medicine Lignum Dalbergia Odorifera extract under HILIC, RPLC and SFC modes indicated the potential of Click TE-CD stationary phase in the analysis of complex samples. The mixed-mode HPLC properties and excellent orthogonality demonstrated its flexibility in HPLC method development and its great potential in two-dimensional liquid
chromatography separation on one HPLC column by different separation modes.
【期刊名称】《色谱》 【年(卷),期】2013(031)003 【总页数】6页(P185-190)
【关键词】β-环糊精固定相;巯基-烯点击化学法;黄酮苷类化合物;正交性 【作 者】徐雪峰;沈爱金;郭志谋;梁鑫淼
【作者单位】中国科学院大连化学物理研究所,辽宁大连116023 【正文语种】中 文 【中图分类】O658
环糊精(cyclodextrin，CD）具有独特的外部亲水、内部疏水特性，人们合成了多种环糊精固定相，用于化合物的分离。在这些环糊精固定相中应用最广泛的是β-CD固定相。自从Armstrong［1］首次将β-CD稳定地共价键合到硅胶上制备成色谱固定相以来，键合CD固定相被广泛应用于正相、反相等模式的高效液相色谱中来分离手性化合物和位置异构体［2，3］。1990 年 Alpert［4］提出亲水色谱(hydrophilic interaction chromatography，HILIC）概念后，人们开始关注β-CD固定相在极性化合物分离方面的应用，将其用于亲水色谱来分离一些中等极性和极性较大的化合物［5－7］。
Kawaguchi等［8］和 Fujimura 等［9］分别合成了硅基氨和酰胺键合固定相，但这些固定相稳定性差，易水解。1985 年，Armstrong［1］通过碳-氧-碳醚键连接方式把β-CD稳定键合到硅胶上，制成不易水解的键合β-CD固定相，该固定相可以有效地分离位置异构体和对映异构体［10］。在此基础上，不同间隔臂的CD键合固定相和衍生化CD键合固定相得到很大发展。比较典型的为Hargitai等［11］用6种不同的空间间隔臂将硅胶和β-CD连接起来，制得不同的β-CD键合手性固定相，并对14种手性化合物进行了拆分。Zhang等［12］通过 Staudinger反应将 β-CD键合到硅胶上，制备了几种不同衍生化的β-CD键合固定相。2001年Sharpless等［13］提出点击化学的概念。由于其具有高效、高选择性等优势，我们课题组把基于Cu(I）催化的叠氮-炔基1，3-偶极环加成反应的点击化学技术应用到色谱固定相合成中，制备了许多新型色谱固定相材料［14－16］。在基于点击化学技术所制备的环糊精固定相中，具有代表性的主要
有:Zhang等［17］以CuSO4/抗坏血酸钠催化体系合成了β-CD键合手性固定相，成功分离了一些手性化合物;Wang等［18］以CuI(PPh3）催化叠氮基修饰的环糊精与端炔修饰的硅胶反应制备了3种环糊精羟基不同取代的 β-CD键合手性固
定相;Guo等［19］通过叠氮修饰的环糊精参与的点击反应合成了新型环糊精固定相，拓展了点击反应合成环糊精固定相途径，并在反相和亲水模式下研究了一些强极性化合物的色谱保留行为;Zhao等［20］通过点击化学法合成了分别以四聚乙二醇、十二烷基二醇为间隔臂的β-CD键合固定相，并考察了其在反相液相色谱模式下的分离行为。随着点击化学研究的深入，巯基-烯(thiol-ene）这类非金属催化，没有金属残留的新型点击化学反应［21］，引起了人们的关注，并作为一种具有应用前景的点击化学反应被应用到固定相合成中。Shen等［22］报道了通过巯基-烯点击化学法合成了一种半胱氨酸键合的两性离子亲水液相色谱固定相，并考察了该固定相在亲水模式下对极性化合物的色谱保留行为以及该固定相在亲水和反相二维色谱中的正交性。Chen 等［23，24］应用巯基-烯点击化学法制备了用于毛细管电色谱的有机-无机杂化硅胶整体柱。基于巯基-烯点击化学反应无需金属催化的优势，本研究采用巯基-烯点击化学法合成了环糊精键合固定相(Click TE-CD），并对该固定相进行表征和色谱性能考察。以极性范围较广泛的黄酮苷样品考察其在反相色谱(RPLC）、亲水色谱(HILIC）、超临界色谱(SFC）等不同分离模式下的保留行为，同时研究其在各种分离模式下的正交关系。最后以含有黄酮类成分的中药样品降香提取物为实际样品，考察不同分离模式下的分离情况。 1 实验部分 1.1 仪器与试剂
高效液相色谱评价所用仪器为Waters Alliance高效液相色谱仪，包括2695型分离单元、自动进样器、柱恒温系统、2996型光电二极管阵列检测器、Empower色谱工作站。超临界流体色谱分析所用仪器为Waters ACQUITY UPC2 TM超高效合相色谱系统，包括分离单元、自动进样器、柱恒温系统、光电二极管阵列检测器、Empower色谱工作站。元素分析结果通过Vario ELⅢ元素分析仪(德国Elementar公司）测得。色谱纯乙腈、甲醇为美国Fisher公司产品，乙酸、乙酸
铵、烯丙胺为美国Acros公司产品，实验用水纯化自Milli-Q系统(美国Millipore公司），无水甲苯，二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺购自天津市科密欧化学试剂有限公司。硅胶(粒径5 μm，孔径10 nm，比表面积300 m2/g）购自日本富士硅化学有限公司，3-巯基丙基三甲氧基硅烷购自德国ABCR公司，偶氮二异丁氰购自上海化学试剂公司。黄酮苷类化合物对照品(纯度大于95%）分别来源于中国药品生物制品检定所(北京）、中国科学院上海有机化学研究所和作者所在课题组自身纯化分离的产品。中药提取物降香是中国科学院知识创新工程重要方向性项目“基于现代理论和技术的复方中药系统研究”中的标准组分。 1.2 Click TE-CD固定相的制备
Click TE-CD固定相的合成主要参考Ai等［25］所做的工作，其合成路线如图1所示。称取10 g硅胶置于三颈圆底烧瓶中，在120℃下干燥过夜。然后加入80 mL无水甲苯，在氮气氛围下搅拌均匀。加入6 mL 3-巯基丙基三甲氧基硅烷，在110℃下回流24 h。反应完毕后，填料用玻璃砂芯漏斗抽滤，分别用20 mL甲苯、二氯甲烷、甲醇、水、甲醇洗涤，在80℃下干燥过夜，得到巯基丙基硅胶(Ⅰ）。 单取代-6A-对甲苯磺酰基-β-环糊精按照Guo等文献［19］所述方法合成。在三颈圆底烧瓶中加入20 g单取代-6A-对甲苯磺酰基-β-环糊精，加入 70 mL烯丙胺，在氮气氛围下搅拌均匀，升温至40℃回流搅拌16 h。反应完毕，加入甲醇分散，然后在搅拌的条件下逐步加入乙腈使产物析出。用玻璃砂芯漏斗抽滤，在40℃下烘干获得单取代-6A-烯丙氨基-β-环糊精(Ⅱ）。
在250 mL三颈圆底烧瓶中，加入60 mL N，N-二甲基甲酰胺。然后加入8 g单取代-6A-烯丙氨基-β-环糊精(Ⅱ），8 g巯基丙基硅胶(Ⅰ）及20 mg偶氮二异丁氰，升温至60℃，在氮气氛围下回流搅拌6 h。反应完毕，用玻璃砂芯漏斗抽滤，分别用30 mL水和甲醇洗涤，然后在80℃下干燥过夜，得到β-环糊精固定相Click TE-CD(Ⅲ）。采用匀浆法将所制备的固定相装填在150 mm×4.6 mm不锈
钢色谱柱管中，用于实验分析。
图1 Click TE-CD固定相的制备Fig.1 Synthesis of Click TE-CD stationary phaseReaction conditions:a.(3-mercaptopropyl）
trimethoxysilane/anhydrous toluene，110 ℃;b.allylamine，40 ℃;c.N，N-dimethyl formamide/2，2'-azobisisobutyronitrile，60℃.Ⅰ.3-mercaptopropyl silca gel;Ⅱ.mono-(6A-N-allyamino-6A-deoxy）-beta-CD;Ⅲ.Click TE-CD. 1.3 色谱条件
黄酮苷类化合物对照品分析条件:流动相A为乙腈;流动相B为100 mmol/L乙酸铵水溶液(pH 4.5）;流动相C为纯水。RPLC模式梯度为:0～30 min，5%A-30%B-65%C→40%A-30%B-30%C;30～35 min，40%A-30%B-30%C;35 ～ 41 min，40%A-30%B-30%C→90%A-0%B-10%C。HILIC模式梯度为:0～35 min，95%A-5%B-0%C→70%A-5%B-25%C;35～36 min，70%A-5%B-25%C。柱温30℃，流速1.0 mL/min，检测波长280 nm，进样体积10 μL。SFC分离流动相为:二氧化碳-甲醇(60∶40，v/v），柱温 40 ℃，流速 2.0 mL/min，提取检测波长280 nm，背压1.3×107Pa，进样体积10 μL。 1.4 数据处理
按照文献［26］方法进行正交性评价，具体方法为:按照方程(1）对溶质在RPLC、HILIC和SFC模式下的保留时间(RT）进行归一化。
其中RTmax和RTmin分别为溶质中最长和最短的保留时间。RTi为溶质保留时间，RTi(norm）为溶质归一化保留时间。
将RPLC、HILIC和SFC模式的归一化保留时间在5×5个小方格上作图，描述二维分离状况，按照方程(2）进行正交度(O）计算。
其中∑bins为归一化保留时间二维分布图上所占格数，Pmax为总格数。 2 结果与讨论
2.1 Click TE-CD固定相的元素分析表征
为了验证β-环糊精是否键合到硅胶表面，采用元素分析仪分别对巯基丙基硅胶Ⅰ和Click TE-CD键合相进行表征。其中巯基丙基硅胶Ⅰ含碳量为3.68%，含氮量为0.08%。而Click TE-CD键合相的含碳量为5.64%，含氮量为0.21%，相比巯基丙基硅胶其含碳量增加1.96%，证明β-环糊精通过巯基-烯点击反应已经成功键合到固定相表面。参照文献［27］，根据其碳含量的增加量计算得到环糊精在硅胶表面的键合量为0.76 μmol/m2。 2.2 Click TE-CD固定相保留机理研究
由于环糊精具有外亲水、内疏水的双重特性，因而Click TE-CD固定相可能具有亲水和反相双重保留特性。因此以3种黄酮苷类化合物为例，研究Click TE-CD固定相在不同乙腈浓度下的保留行为。3种黄酮苷类化合物在Click TE-CD固定相上的保留时间随乙腈浓度的变化曲线均为U形，即黄酮苷类化合物在RPLC和HILIC模式下都能很好地保留(见图2）。在0～50%乙腈范围内，保留时间随乙腈含量增大而减小，表现出RPLC的保留特性。而当乙腈含量在50%以上时，保留时间随乙腈含量增大而增大，表现出HILIC的保留特性。这与前人报道一致，是亲水、反相双重保留行为的典型特征［28］。
图2 黄酮苷保留时间与流动相中乙腈含量的关系Fig.2 Dependency of retention times of flavone glycosides on acetonitrile(ACN）contentMobile phase:10 mmol/L NH4Ac in ACN solution(pH 6.3）with content of ACN as indicated;flow rate:1.0 mL/min;UV detection:280 nm. 2.3 Click TE-CD固定相在各种色谱分离模式下的正交性
黄酮苷是一类极性范围较广的化合物。由于RPLC、HILIC、SFC的分离机理有差异，且环糊精内外的亲水性存在差异，黄酮苷在各种分离模式下的选择性应有所区别。采用Gilar等［26］发展的几何计算方法，选取25种黄酮苷类化合物，研究了Click TE-CD固定相在RPLC、HILIC、SFC各种分离模式下的正交性。黄酮苷类化合物在3种分离模式下的保留时间和归一化保留时间见表1。溶质样品数为25，因此二维空间被划分为25个方格，对溶质在任意两种分离模式下的归一化保留时间作图，分布到二维空间中(见图3）。根据二维空间被占据的方格数，计算出每2种分离模式下的正交度。结果表明，RPLC和HILIC模式下的正交度为69.8%、RPLC和SFC模式下的正交度为50.8%、HILIC和SFC模式下正交度为50.8%，而且从图4中可以看出，汉黄芩苷在3种分离模式下的保留行为具有显著差异性。因此，Click TE-CD在构建二维液相色谱方面具有一定的潜在优势，可以在一根色谱柱上实现两种不同模式的分离。Click TE-CD固定相在各种不同的分离模式下的良好正交性是由环糊精的特殊结构所决定的。疏水的空腔和亲水的外缘可以使环糊精分子提供多种作用力，包括氢键作用力、疏水作用力和偶极作用力等，因此存在多种保留机理。不同机理涉及截然不同的分子间作用力，适用于不同的色谱分离模式，因此产生很好的正交性。
图3 黄酮苷在各种分离模式下的归一化保留时间Fig.3 Normalized retention time plots of flavone glycosides under different separation modes 2.4 Click TE-CD固定相在分析降香提取物中的应用
降香是一种传统中药材，药理学研究表明降香中的有效成分具有抗炎、抑制中枢神经系统、抗凝血和血管舒张、抗血脂等作用。降香中的主要成分为挥发油和黄酮类化合物。对这些化合物的分离和结构鉴定有利于降香的物质基础研究。本研究采用降香提取物为分离对象，考察Click TE-CD固定相在RPLC、HILIC和SFC分离模式下的分离情况。从图5中可见降香提取物在SFC和RPLC模式下分离情况较好，
而在HILIC模式下分离情况较差。这可能是由于降香中所含的极性黄酮类成分较少的缘故。但从3种分离模式的谱图形貌的差别来看，Click TE-CD固定相在3种分离模式下具有不同的分离选择性，这揭示了多维液相色谱分离复杂样品的潜力。因此，Click TE-CD固定相可以用于分离复杂样品体系。不同分离模式在分离机理上的差别，使得应用该固定相建立多维色谱分离系统成为可能。 图4 汉黄芩苷在不同分离模式下的色谱图Fig.4 Chromatograms of wogonoside under different separation modes
表1 黄酮苷类化合物在不同分离模式下的保留时间和归一化保留时间Table 1 Retention times and normalized retention times of flavone glycosides under different separation modesNumber Flavone glycoside Normalized retention Normalized retention Normalized retention time 1 acacetin-7-rutinoside 17.157 0.597 2.217 0 RPLC Retention time/min time HILIC Retention time/min time SFC Retention time/min.008 5.342 0.2982 apigenin-5-O-β-glucoside 13.677 0.402 10.666 0.632 2.298 0.0753 ahyrsin-6-C-α-L-arabinopyranosyl-8-C-β-D-glucopyranoside 10.584 0.229 15.655 1 12.543 0.8254 chyrsin-8-C-α-L-arabinopyranosyl-6-C-β-D-glucopyranoside 13.558 0.395 13.615 0.849 13.074 0.8645 wogonoside 24.346 1 15.249 0.970 2.174 0.0666 hesperidin 12.386 0.330 6.314 0.310 6.898 0.4127 puerarin 8.025 0.085 8.093 0.442 6.008 0.3478 3'-methoxypuerarin 7.259 0.043 6.653 0.336 4.999 0.2739 3'-hydroxypuerarin 6.500 0 9.966 0.580 9.279 0.58610 4'-methoxydaidzin 15.227 0.489 4.715 0.193 3.670 0.17511 daidzin 11.012 0.253 5.378 0.238 4.890 0.26512 puerarin-6″-apioside 7.605 0.062 11.577 0.699 10.508 0.67613 genistin 12.651 0.345 4.334 0.164 4.177 0.21314 formononetin-8-C-apiosyl(1→6）-glucoside 11.070 0.256 9.237
0.526 6.911 0.41315 formononetin-8-C-xylosyl(1→6）-glucoside 10.646 0.232 11.976 0.728 8.155 0.43816 1，5，8-trihydroxy-3-methoxy-xanthonoid-8-O-glucoside 12.956 0.362 4.843 0.202 3.145 0.13717 1，7，8-trihydroxy-3-methoxy-xanthonoid-7-O-xylosyl(1→2）xyloside 17.710 0.628 5.596 0.258 3.580 0.16918 1，7，8-trihydroxy-3-methoxy-xanthonoid-7-O-rhamnosyl(1→2）xyloside 18.224 0.657 5.488 0.250 4.010 0.20019 1-hydrox-3，7，8-trimethoxy-xanthonoid-1-O-pimeoeroside 15.854 0.524 8.822 0.496 5.450 0.30620 1-hydrox-2，3，4，5-tetramethoxy-xanthonoid-1-O-pimeoeroside 13.664 0.401 8.228 0.452 4.890 0.26521 1，5，8-trihydroxy-3-methoxyxanthonoid 20.058 0.760 2.152 0.003 1.325 0.00422 1-hydrox-3，7，8-trimethoxyxanthonoid 23.335 0.943 2.106 0 1.275 023 kaempferol-3-O-［2-O-(6-O-E-ferloyl）-β-D-glucopyranosyl］-β-D-galactopyranoside 14.235 0.433 14.042 0.881 11.266 0.73224 quercetin-3-O-［2-O-(6-O-E-ferloyl）-β-D-glucopyranosyl］-β-D-galactopyranoside 12.800 0.353 15.281 0.972 14.930 125 neohesperidin 12.614 0.343 6.700 0.335 7.152 0.430
图5 Click TE-CD固定相在HILIC、RPLC和SFC模式下分离降香提取物的色谱图Fig.5 Chromatograms of Lignum Dalbergia Odorifera extract separated on Click TE-CD stationary phase under HILIC，RPLC and SFC modesFor HILIC and RPLC，mobile phase A:ACN;mobile phase B:100 mmol/L NH4Ac(pH 4.5）;mobile phase C:water.Gradient for HILIC:0－30 min，95%A-5%B-0%C→70%A-5%B-25%C;30－35 min，70%A-5%B-25%C.Gradient for RPLC:0－25 min，5%A-30%B-65%C→40%A-30%B-30%C;25－30 min，40%A-30%B-30%C;30－32 min，40%A-30%B-30%C→90%A-0%B-
10%C.Column temperature:30℃;flow rate:1.0 mL/min;UV detection:280 nm;injection volume:10 μL.For SFC，mobile phase A:CO2;mobile phase B:methanol.Gradient for SFC:0 － 30 min，95%A-5%B→60%A-40%B;30－35 min，60%A-40%B→95%A-5%B.Column temperature:40℃;flow rate:2.0 mL/min;UV detection:280 nm;back pressure:1.3×107Pa;injection volume:10 μL. 3 结论
制备了基于巯基硅胶与单取代-6A-烯丙氨基-β-环糊精点击反应的β-环糊精共价键合固定相，考察了其在RPLC、HILIC和SFC模式下对黄酮苷类化合物的分离。色谱保留行为研究结果表明Click TECD固定相具有反相和亲水的双重保留特性，并且可以用于超临界流体色谱。由于Click TE-CD在各种分离模式之间具有较好的正交互补性，可以在一根色谱柱上通过改变流动相实现不同分离模式的转换和分离选择性调控。其在复杂中药组分的多模式分离中具有较好的应用价值。 参考文献：
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