丙二醛的测定

植物组织中丙二醛的测定

实验原理：

植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化作用的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。丙二醛在酸性和高温条件，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3,5,5—三甲基恶唑2,4-二酮)，在532nm处有最大光吸收，在600nm处有最小光吸收，该复合物的吸光系数为155[mmol/( L.cm )] ，可按公式：A532－A600=155000×C×L算出MDA浓度C(μmol/L)，进一步算出单位重量鲜组织中 MDA 含量(μmol/g)。式中，A532和A600分别表示532nm和600nm处的吸光度值。L为比色杯厚度(cm )。

需要指出的是，植物组织中糖类物质对MDA-TBA反应有干扰作用。为消除这种干扰，经试验，可用下列公式消除由蔗糖引起的误差。

C(μmol/L)=6.45(A532－A600)-0.56A450

式中： A450、A532和A600分别表示450nm、532nm 和600nm处的吸光度值。算出植物样品提取液中MDA的浓度后，可进一步算出其在植物组织中的含量。

实验材料、试剂与仪器设备

（一）实验材料

植物的根或叶片。

（二）试剂

1、5%三氯乙酸(TCA)。

2、0.6 %硫代巴比妥酸(TBA)溶液：称取硫代巴比妥酸0.6g溶于5％TCA溶解并用其定容至l00mL 。

（三）仪器设备

研钵，恒温水浴锅，分光光度计，离心机，天平，刻度试管，移液管

实验步骤

1.MDA的提取 称取植物材料1g，剪碎，加入2mL5%TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8mLTCA进一步研磨，匀浆在4000r/min离心10min，上清液为样品提取液。

2. 显色反应和测定 吸取离心的上清液2mL(对照加2mL蒸馏水)，加入2 mL0.6%TBA溶液，摇匀。将试管放入沸水浴中煮沸10min(自试管内溶液中出现小气泡开始计时)，取出试管并冷却，3000r/min离心15 min，取上清液并量其体积。以0.6％TBA 溶液为空白测定532nm、600nm和450nm处的吸光度值。

结果计算

MDA 含量 ( μmol/g)=

实验四十二 植物体内丙二醛含量的测定

一、目的

通过实验，掌握植物体内丙二醛含量测定的原理及方法。

二、原理

丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的。它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。测定植物体内丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸(TBA)在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5－三甲基恶唑2、4－二酮），三甲川最大的吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100－300μg·g－1Dw，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3＋的终浓度为0.5nmol· L－1。在532nm、600nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。

三、材料、仪器设备及试剂

1. 材料：植物叶片。

2. 仪器设备：离心机，分光光度计；电子分析天平；恒温水浴；研钵；试管；移液管（1ml、5ml）、试管架；移液管架；洗耳球；剪刀。

3. 试剂：10％三氯乙酸；0.6％硫代巴比妥酸（TBA）溶液：石英砂。

四、实验步骤 1. 丙二醛的提取

称取受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片1g，加入少量石英砂和10％三氯乙酸2ml，研磨至匀浆，再加8ml10％三氯乙酸进一步研磨，匀浆以4000r/min离心10min，其上清液为丙二醛提取液。

2. 显色反应及测定

取4支干净试管，编号，3支为样品管（三个重复），各加入提取液2ml，对照管加蒸馏水2ml，然后各管再加入2ml 0.6％硫代巴比妥酸溶液。摇匀，混合液在沸水浴中反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液分别在532、600和450nm波长下测定吸光度（A）值。

五、丙二醛含量计算：

由于蔗糖－TBA反应产物的最大吸收波长为450nm，毫摩尔吸收系数为85.4×10－3，MDA－TBA反应产物在532nm的毫摩尔吸收系数分别是7.4×10－3和155×10－3。532nm非特异性吸光值可以600nm波长处的吸光值代表。

按双组分分光光度法原理，建立方程组，解此方程组即可求出MDA及可溶性糖浓度。

方程组：

A450=（85.4×10－3）·C糖

（A532－A600）=（155×10－3）·CMDA+（7.4×10－3）·C糖

解得：

A450

C糖= —————— = 11.71A450（mmol·L－1）

85.4×10－3

CMDA= 6.45（A532－A600）－0.56A450-（μmol·L－1）

公式中：A450—在450nm波长下测得的吸光度值

A532—在532nm波长下测得的吸光度值

A600—在600nm波长下测得的吸光度值

﹡ —1.55×105为摩尔比吸收系数

C糖、CMDA分别是反应混合液中可溶性糖、MDA的浓度。

1. 按下式计算提取液中MDA浓度

反应液体积（ml）

CMDA × —————————

1000

提取液中MDA浓度（μmol·ml－1）= ———————————————

测定时提取液用量（ml）

2. 按下式计算样品中MDA含量

提取液中MDA浓度（μmol·ml－1）×提取液总量（ml）

MDA含量（μmol·g－1 Fw）= ————————————————————————

植物组织鲜重（g）