超声辅助提取藤茶多糖的工艺优化及其成分分析

王慧宾;熊伟;韩晓丹;胡银;付建平;邓朝阳

【摘 要】本文采用超声辅助技术,以高效提取藤茶中的水溶性活性多糖为主要目的,通过单因素实验和正交实验,对超声功率、提取温度、提取时间以及液料比对藤茶多糖的得率影响进行了工艺优化。结果表明,在超声功率1 000W,提取温度50℃,提取时间15min,液料比30∶1的工艺条件下,藤茶粗多糖得率最高可达6.74%。通过紫外-可见光谱、红外光谱分析表明,藤茶多糖是一种富含糖醛酸的多糖,其中性糖含量为40.11%,糖醛酸含量为41.37%。与热水提取法比较,超声辅助提取工艺具有提取温度低、提取时间短、效率高的特点,且获得的藤茶多糖产品性状好、得率高。 【期刊名称】《生物化工》 【年(卷),期】2016(000)001 【总页数】5页(P7-11)

【关键词】藤茶;多糖;超声提取;正交实验

【作 者】王慧宾;熊伟;韩晓丹;胡银;付建平;邓朝阳 【作者单位】江西省科学院应用化学研究所 【正文语种】中 文 【中图分类】TQ281

在植物、动物及微生物细胞中都存在不同类型的天然活性多糖，它们具有分子量大、结构复杂等特点。多糖独特的结构赋予了它们特有的免疫活性、抗肿瘤、降血糖、抗氧化等生物活性[1]。近年来，越来越多的研究者开始从植物、动物及微生物中

提取天然活性多糖[2，3]。藤茶，学名显齿蛇葡萄(Ampelopsis grossedentata)，又名莓茶、长生藤，是广泛分布于我国南方各山区的一种野生藤本植物[4]。藤茶中富含黄酮类物质，当茶饮别有风味，且回味甘甜，又有一定的药理作用（如消炎、杀菌作用），因此在民间广受欢迎。近年来，对藤茶中的黄酮类物质研究较多[5，6]，而对其活性多糖的研究较少[7]。传统的热水提取多糖技术用于藤茶多糖的提取存在温度高、耗时长的特点[8]，本文在已有研究的基础上[9]，开发了一种超声辅助高效提取藤茶中水溶性活性多糖的工艺，旨在提高效率、节约能耗。通过单因素和正交实验优化了工艺参数，并对提取的多糖进行了初步的理化性质检测。 1.1 材料与仪器

野生藤茶，采自江西省抚州市黎川县。浓硫酸、苯酚、无水乙醇、四硼酸钠、葡萄糖、葡萄糖醛酸、间羟基联苯等，均为分析纯试剂。

超声循环提取机（HF-5B型，北京弘祥隆生物技术开发有限公司），紫外-可见分光光度计（TU-1810型，北京普析通用仪器有限责任公司），冷冻干燥机（FD-1C50型，北京博医康实验仪器有限公司），台式高速大容量冷冻离心机（H2050R型，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），傅立叶变换红外光谱仪（FTIR-7600型，天津港东科技发展股份有限公司）。 1.2 实验方法 1.2.1 藤茶的预处理

收集到的藤茶茎叶人工除去大部分粗枝后，将藤茶叶在烘箱中60℃下充分干燥至恒重，高速粉碎机粉碎，过40目筛，置干燥处保存备用。 1.2.2 藤茶多糖的提取流程和条件优化

藤茶粉碎料和水以一定配比混合后开始超声提取。一定时间后料液混合物进行高速离心，弃去残渣，上清液用旋转蒸发仪浓缩，继而用80%的乙醇沉淀。再次离心，所得沉淀用无水乙醇洗涤3次，真空抽干或以水复溶后冻干，称重后计算得率。

得率为多糖净重和藤茶原料的比值。

以蒸馏水为提取剂，基础条件确定为液料比50∶1，时间10min，温度50℃，功率800W的条件下分别进行单因素实验。液料比范围在20∶1、30∶ 1、40∶ 1、50∶ 1、60∶ 1、70∶ 1和80∶1；提取时间范围在3、5、10、15、20min和25min；提取温度范围在30、40、50、60℃和70℃；提取功率范围在250、600、800、1 000W和1 200W。 1.2.3 红外光谱分析

取100℃充分干燥的藤茶多糖少量，与一定比例干燥的溴化钾粉末混合后置于玛瑙研钵中充分研磨，压片，测定其红外光谱，扫描波数范围4 000～400cm-1。 1.2.4 中性糖和糖醛酸测定方法

以葡萄糖为标准对照，采用苯酚-硫酸法测定藤茶多糖的中性糖含量。精确移取浓度为0.05mg/mL的葡萄糖标准溶液0.2～0.9mL并定容至1.0mL，随后加入质量分数为6%的苯酚水溶液0.5mL，混匀，分别加入浓硫酸5.0mL，快速充分摇匀，室温下静置10min后，测定490nm处吸光度，并以葡萄糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标建立回归方程（见图1）：Y=0.009 47X-0.017 900（R2=0.995 6）。藤茶多糖样品配制成0.05mg/mL的水溶液，取1.0mL按上述步骤相继加入苯酚和浓硫酸，测定490nm处吸光度，根据回归方程计算样品的中性糖含量。 以葡萄糖醛酸为标准对照，采用间羟基联苯法测定藤茶多糖的糖醛酸含量。精确移取浓度为0.06mg/mL的葡萄糖醛酸标准溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4mL 和0.5mL并加水定容至0.5mL，在冰浴中逐滴加入12.5mM的四硼酸钠的硫酸溶液1.5mL。混匀后在沸水浴中加热5min，冷至室温后分别加入0.15%的间羟基联苯的0.5%的氢氧化钠溶液0.025mL，混匀后在520nm处测定吸光度，以葡萄糖醛酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标建立的回归方程为（见图2）：Y=0.001 81X-0.000 214（R2=0.994 3）。藤茶多糖样品配制成0.06mg/mL的水溶液，

取0.5mL按上述步骤操作并测定520nm处吸光度，根据回归方程计算样品的糖醛酸含量。 2.1 单因素实验

单因素实验选择了液料比、温度、超声功率和时间等对藤茶多糖得率影响较大的4个因素进行考察。以多糖得率为纵坐标，4个影响因素为横坐标分别作图，从而对影响多糖得率的因素进行直观分析。

从图3可以看出，藤茶多糖的得率随液料比的增大，得率反而下降，同时液料比过大时，后续的离心、浓缩操作也会增大时间成本，并可能对多糖活性产生一定影响。因此，液料比控制在40∶1以内比较合适。

从图4看出，温度对藤茶多糖的得率影响很大，温度在30℃和40℃时，得率只有4%左右，而在60℃和70℃下，得率迅速增大至6%以上。但实验表明，温度继续升高后，虽然得率还有缓慢增加，但浓缩后得到的多糖产品颜色很深，不利于进一步的纯化，因此，最佳温度应控制在50～70℃。

不同的超声功率对藤茶多糖得率的影响如图5所示，从图中可以看出，在50℃的温度和较低的功率下，多糖得率很低；当功率变大后，多糖的得率随功率增加而迅速增大。但实验中发现，当功率过高时，提取混合液随时间的延长，容易被破碎过度而变成悬浊液，不利于后续的离心分离，因此适宜的超声功率在1 000 W左右。 超声时间对藤茶多糖得率的影响如图6所示，可见随时间延长藤茶多糖得率也相应增加，但20min以后，多糖得率不再增加，说明多糖已基本全部溶出，因此最佳的提取时间应在20min以内。 2.2 正交实验

根据以上单因素实验结果，对液料比、温度、超声功率、时间4个因素分别选取3个水平进行了四因素三水平的正交实验优化，如表1所示。

正交实验结果和极差分析如表2所示。极差结果分析表明，影响多糖得率的因素

顺序从大到小分别为：功率、时间、温度和液料比。综合分析后，最佳方案选择为A2B3C2D3，即液料比30∶1，时间15min，温度50℃，功率1 000W。在此条件下进行了验证试验，多糖得率为6.74%，说明正交实验优化结果较好。 2.3 藤茶多糖成分分析 2.3.1 藤茶多糖的红外光谱测定

藤茶多糖的红外光谱如图7所示，其中1 629.55cm-1处为羧基上O-C-O的非对称伸缩振动，而1 415.49 cm-1处为C-OH变角振动和羧基上O-C-O对称伸缩振动[10]，两者均说明藤茶多糖很可能为一种糖醛酸多糖，继而下一步对藤茶多糖分别进行了中性糖和糖醛酸含量的测定。 2.3.2 藤茶多糖的中性糖和糖醛酸含量测定

苯酚-硫酸法测定多糖的原理是多糖被硫酸脱水后生成糖醛衍生物，继而和苯酚生成橙黄色物质，从而可在490nm波长处测定其吸光度。以葡萄糖为标准进行对照，计算可得藤茶多糖的中性糖含量为40.11%。间羟基联苯法测定多糖的原理是利用多糖中的糖醛酸残基在四硼酸钠和间羟基联苯的共同作用下，在520nm处生成特异吸收峰。本文以葡萄糖醛酸作为标准对照，测得藤茶多糖的糖醛酸含量为41.37%。

和传统的水热提取法相比，超声辅助提取技术可显著降低提取温度和时间。本文通过正交实验优化后，得到最佳工艺参数为：液料比30∶1，超声时间15min，功率1 000W，温度50℃。在此条件下藤茶多糖得率可达6.47%，所得多糖颜色为灰白色，利于多糖的进一步纯化。本工艺操作路线适宜于工业化操作，可为藤茶多糖的生产提供参考依据。

【相关文献】

[1]方积年,丁侃.天然药物——多糖的主要生物活性及分离纯化方法[J].中国天然药物,2007,5(5):338-347.

[2]薛丹,黄豆豆,黄光辉,等.植物多糖提取分离纯化的研究进展[J].中药材，2014，37(1):157-161. [3]谢红旗,周春山,杜邵龙,等.酶法提取、超滤分离香菇多糖新工艺研究[J].食品科学,2007,28(4):217-219.

[4]覃骊兰.藤茶的化学成分及药理作用研究进展[J].上海中医药杂志,2008,42(6):94-96.

[5]杨铃,郑成,宁正祥.正交实验设计优选二氢杨梅素的提取工艺[J].食品工业科技,2005,26(5):95-97. [6]杨文,李海霞,陈丽珍,等.二氢杨梅素-镍配合物的合成及抗菌活性的研究[J].食品工业科技,2013,34(14):122-126.

[7]罗祖友,陈根洪,郑小江,等.藤茶多糖AGP-3的分离纯化与结构的初步鉴定[J].时珍国医国药,2009,20(7):1707-1709.

[8]罗祖友,杨晓萍,吴谋成.藤茶水溶性多糖及总黄酮的提取工艺[J].食品科学,2005,26(5):156-160. [9]熊伟,王慧宾,李雄辉,等.热水浸提法同步提取藤茶中二氢杨梅素和多糖的工艺研究[J].生物化工,2015,1(1):5-6.

[10]王彩,施松善,洪其明,等.裙带菜中聚甘露糖醛酸的分离纯化与结构分析[J].高等学校化学学报,2009,30(11):2189-2192.