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不同分子量壳聚糖和壳聚糖硫酸酯的抗氧化活性

2020-04-03 来源:榕意旅游网
第22卷第9期2005年9月应用化学CHINESEJOURNALOFAPPLIEDCHEMISTRYV01.22No.9Sep.2005不同分子量壳聚糖和壳聚糖硫酸酯的抗氧化活性邢荣娥q6刘松小于华华咖郭占勇叫王丕波础李智恩4李鹏程”(4中国科学院海洋研究所青岛266071;6中国科学院研究生院北京)摘要以吩嗪硫酸甲酯一还原型辅酶I烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)为超氧阴离子自由基(0;‘)产生、检测体系和EDTANa2-Fe(Ⅱ)-H:O:为羟自由基(·OH)产生、检测体系,对不同分子量壳聚糖和硫酸酯衍生物进行了抗02.一和·OH自由基的活性研究。结果表明,壳聚糖分子量大小对02.一和·OH自由基的清除能力有较大影响。质量浓度为1.6g/L和壳聚糖分子量为9×103时,对0;一清除率达85.86%,而分子量在7.6×105时,对O;‘清除率仅为35.50%;壳聚糖硫酸酯对于Oi一自由基的清除能力明显高于壳聚糖;在质量浓度为0.05g/L时,低分子量壳聚糖硫酸酯对0i一自由基的清除能力达到86.26%;壳聚糖硫酸酯对·OH自由基的清除能力(89.82%)低于相同分子量的壳聚糖(91.22%),而高于高分子量壳聚糖7.6×105(16.77%);低分子量壳聚糖硫酸酯对0i一和·OH自由基的清除能力高于高分子量壳聚糖硫酸酯;各样品对Oi一和·OH自由基的清除能力均随着质量浓度的增加而上升,壳聚糖硫酸酯在相当低的质量浓度下(0.1g/L)就可以达到明显清除0i一自由基的效果(≥90%)。关键词壳聚糖,壳聚糖硫酸酯,超氧阴离子自由基(O’一):,羟自由基(·OH),抗氧化活性中图分类号:0629;0636文献标识码:A文章编号:1000-0518(2005)09-0958-04活性氧自由基对机体具有巨大的损伤作用,如引起蛋白质损伤、酶失活、膜质过氧化,导致衰老、肿瘤、动脉粥样硬化等许多疾病的发生uJ。因此筛选对人体安全、高效的活性氧清除剂具有重要的意义。海洋生物活性多糖具有较高抗氧化能力,如鼠尾藻多糖能有效地清除活性氧自由基【21;浒台多糖能提高超氧化物歧化酶(SOD)活力及降低血清过氧化脂质(120)的含量【3J。壳聚糖(CTS)是一种来源于甲壳类动物(蟹虾)的外壳及节肢类动物(蟑螂等)骨骼的天然碱性高分子多糖,对人体无毒、可生物降解。但高分子量CTS分子结构紧密,抗氧化作用不很明显H1;低聚壳聚糖人体易于吸收,具有活化淋巴细胞、增强机体免疫力、抗菌抑菌、抑制肿瘤细胞的生长等生理活性NJ,抗氧化活性高于高分子量CTSHJ。Park等怕1研究了不同脱乙酰度壳聚糖的抗氧化能力,发现脱乙酰度越高,清除羟自由基、超氧自由基和有机自由基的效果越好;解文明等¨o发现壳聚糖的马来酸酐化水溶性衍生物具有清除羟自由基的活性;壳聚糖的硫酸酯化衍生物由于具有与肝素类似的结构和强聚阴离子性质,在抗凝随】、抗栓一J和抗病毒¨叫方面的研究均有报道。壳聚糖硫酸酯衍生物对H:O:有明显的抗氧化活性¨1l,但还未见有关清除O2.一和·OH自由基的报道。本文就壳聚糖、低分子量壳聚糖及其相对应分子量的硫酸酯化衍生物对超氧阴离子自由基和羟自由基的清除作用进行初步探讨。1实验部分1.1试剂和仪器壳聚糖(CTS)(青岛百成有限公司),DD=85%,Mw=7.6×106,食用级。还原型辅酶I烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH),硝基四氮唑蓝(NBT),吩嗪硫酸甲酯(PMS)均为sigma产品,藩红花为生物染色素,其它试剂均为分析纯。Magna—AVATAR360型红外光谱仪(美国);722型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);LG温控微波炉(天津乐金电子电器有限公司)。Nicolet2004—11—18收稿,2005-03-23修回青岛市科技局资助项目(H11022506)通讯联系人:李鹏程,男,1957年生,博士,研究员;E·mail:pcli@ms.qdio.ac.on;研究方向:海洋药物万方数据 第9期邢荣娥等:不同分子量壳聚糖和壳聚糖硫酸酯的抗氧化活性9591.2实验方法1.2.1不同分子量壳聚糖的制备采用微波降解法u刘自制了2种低分子量样品LCTS和LLCTS,由粘度法测得其分子量分别为1.2X105和9×103。1.2.2不同分子量壳聚糖硫酸酯的制备将50~100mL磺化试剂(氯磺酸.DMF)滴加到7.6×105壳聚糖中,在40—60℃下反应2-4h,得到分子量为1.2X105的高分子量壳聚糖硫酸酯(HCTSS);采用微波辐射法¨列制备了分子量为9X103的低分子量壳聚糖硫酸酯(LCTSS),并用BaCI:一明胶法测定硫酸根含量(硫酸根占葡萄糖残基的质量分数)分别为44.5%和43.7%。1.2.3不同分子量壳聚糖和壳聚糖硫酸酯对超氧自由基的清除作用参照文献[14]方法,采用吩嗪硫酸甲酯.NADH体系。反应体系为3.0mL的Tris-HCl缓冲液(16mmoL/L,pH=8.0),其中含有78txmoL/LNADHj50i山moL/LNBT、10¨moL/LPMS,以及不同浓度3.3mg/L一3.3g/L的多糖溶液。超氧阴离子和NBT的显色反应采用分光光度法在560am波长,20℃下测定反应液的吸光度。在空白对照实验中,用Tris—HCl缓冲液替换NADH。实验结果以清除率E(%)表示:晰)=箍x100%式中,A和A,分别为空白和加人样品后的吸光度值,参比值A。=0。1.2.4不同分子量壳聚糖和壳聚糖硫酸酯对羟自由基(·OH)的清除作用参照文献[15]方法,·OH是由EDTANa:一Fe(Ⅱ)一H:0:体系产生,由于·OH可使藩红花红色褪色,因此可用比色法来测量·OH的含量。反应体系中有pH=7.4的磷酸缓冲液1.5mL,藩红花红(260mg/L)0.2mL,3%的H:0:0.8mL,EDTANa:一Fe(Ⅱ)0.7mL,一定量不同浓度的壳聚糖溶液,混合均匀后于37℃水浴保温30min,然后在20℃下测520Bill处吸光度A值。空白组以重蒸馏水代替供试液,对照组以重蒸馏水代替供试液和EDTANa:一Fe(II),反应总体积为4.0mL。清除率F(%)为:F(%):兰警二等L×100%A对照一A空白2结果与讨论2.1壳聚糖及其硫酸酯衍生物对02『一的清除活性从图1的未降解的壳聚糖CTS(图1曲线C)、低分子量壳聚糖LCTS(图1曲线d)和LLCTS(图1曲线e)、高分子量壳聚糖硫酸酯HCTSS(图1曲线b)和低分子量壳聚糖硫酸酯LCTSS(图1曲线a)对02.一的清除率结果可见,CTS和LCTS对O2.一的清1除率很低,LLCTS对02『一则具有明显的清除活性,在质量浓度为1.6g/L时清除率可达85.86%。而LCTSS和HCTSS在相当低的质量浓度(0.1g/L)时,对Oj一的清除率就已经达90%以上。蓬由图1还可看出,随着样品质量浓度增大,它们对O;一的清除作用加强。尤其是壳聚糖的硫酸酯化产物LCrI’SS和HCTSS在很小的浓度变化范围内(0.005~0.1g/L)对O2.一的清除作用发生剧变,0.1g/L时对O2.一的清除率已达到90%以上。由图可查出LCTSS和HCTSS清除02一的IC50(清除率图1不同分子量壳聚糖(曲线c~e)和达到50%时的浓度¨叫)为0.015—0.02g/L,较已壳聚糖硫酸酯(a和6)对oi。的清除作用经报道的鼠尾藻多糖和褐藻多糖的IC50分别低数倍Fig.1Scavengingeffectof(c—e)chitosansand和数十倍口]。这说明壳聚糖硫酸酯化产物是一种活(口,6)sulfatedchitosanswithdifferentmolecular性极强的Oj一的清除剂。welghton8upem删8radlcal壳聚糖分子中存在还原端羰基、伯、仲一OH、MW/。D池9;6·120;c.760;d·120;e.9万 方数据应用化学第22卷一NH:,可与O2.一发生反应,清除掉02-一。壳聚糖对Oi一的清除效果随着分子量降低而增强,这与其它生理活性(如抗菌抑菌、吸湿保湿等)m1有相似的规律。这可能是高分子量壳聚糖由于氢键作用,结构紧密,使得壳聚糖分子中活性官能团与O2.一的作用机率降低;而壳聚糖降解后其活性官能团暴露,易与Oj一充分作用。这一解释同样适用于对羟自由基的清除作用。2.2壳聚糖及其硫酸酯衍生物对羟自由基(·OI-I)的清除活性壳聚糖及其硫酸酯衍生物对·OH自由基的清除活性见图2所示。图中可见,壳聚糖对羟自由基的清除能力随着分子量降低而增强。在质量浓度为g/L时未降解的壳聚糖(图2曲线o)对羟自由基清除率仅为16。77%,而LLCTS(图2曲线c)对3.2·OH的清除率高达91.22%。壳聚糖硫酸酯衍生物也遵循上述规律,在质量浓度为3.2g/L时,LCTSS(图2曲线e)对·OH的清除率高达89.82%,而HCTSS(图2曲线d)仅为60%。从图2还显示出在相近的分子量下,r,CTSS(图2曲线e)对·OH的清除能力低于LLCTS(图2曲线c),质量浓度大于2.0g/L时,HCTSS(图2曲线d)对·OH清除能力图2不同分子量壳聚糖(曲线a~c)和壳聚糖硫酸酯(曲线d,e)对·OH的清除作用Fig.2Inhibitingeffect强于LCTS(图2曲线6),而浓度低于2.0g/L时,LCTS对·OH的清除能力强于HCTSS。图2还说明各样品对·OH的清除能力随着浓度增大而增强,LLCTS和LCTSS变化最为显著。LLCTS、LCTSS和HCTSS的Ic50分别为0.7、1.3和2.8of(o~c)ehitosansanddifferentmdecular(d,P)sulfatedehitosans诵t11weighthyaroxylradicalg/L,其作用比常用的羟自由基抑制剂甘露醇MW/kD:a.760;6.120;c.9;d.120;e.9(IC50为4.0g/L)¨41强。多糖及其降解产物中存在大量含有活泼氢的羟基,而羟自由基可与多糖中的活泼氢原子形成相当稳定的大分子自由基。壳聚糖中不仅含有活泼羟基,还有大量活泼氨基的存在,对羟自由基有如下作用m1:(1)羟基的氢原子与羟自由基作用而达到清除·OH的且的;(2)氨基与羟自由基反应生成稳定的大分子自由基;(3)NH:先与溶液中的氢作用形成氨正离子NHf,再与羟自由基作用形成稳定物质。参考文献12ZHAOWen-En(赵文恩),HANYa·Shah(韩雅珊),SaishiH.ActaBiophysZHANGSin(生物物理学报)[J],1997,13(1):137Er-Xian(张尔贤),YuJun-Li(俞君丽),XIAOXiang(肖湘).ChinJMarDrugs(中国海洋药物)[J],1995,15(】):134ZHOUHui-Ping(周惠萍),BANGXun—Tian(蒋巡天).ChinBiochemYIN325J(生物化学杂志)[J],1995,11(2):161Xue-Qiong(尹学琼),LINQiang(林强),ZHANGQi(张岐),eta/.ChinJApplChem(应用化学),2000,19(4):5CHAI4:36Hal-Ping(柴海平),ZHANGWen—Qing(张文清),JINXin-Rong(金鑫荣).Un/vChem(大学化学)[J],1999,678ParkPXieJ,JeJY,KimSK.Carbohydrpotym[J],2004,55:17Lett[J],2001,11:1699wl,XuPX,“uQ.BioorgMedChemHagiwaraK,KuribayashiY,LwaiH,eta/.CarbohydrP0咖[J],1999,39(3):24591011AmijiMM.Co//o/d3Su召rB[J],1998,10:263a1.CarbohydrRes[J],1998,306:427NishimuraSI,KaiH,ShinadaK,etHUJin—Feng(胡金凤),GENGMei—Yu(耿美玉),YuCuang-Li(于广利),eta1.ChinJMarineDrugs(中国海洋药物)[J],2001,1:2512DINGYing—Hong(丁盈红),LIRuo-Qi(李若琦),wuKun—Xian(伍锟贤),eta1.ChinJBiochemPharm(中国生化药万方数据 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方数据不同分子量壳聚糖和壳聚糖硫酸酯的抗氧化活性

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邢荣娥, 刘松, 于华华, 郭占勇, 王丕波, 李智恩, 李鹏程, XING Rong-E, LIUSong, YU Hua-Hua, GUO Zhan-Yong, WANG Pi-Bo, LI Zhi-En, LI Peng-Cheng邢荣娥,刘松,于华华,郭占勇,王丕波,XING Rong-E,LIU Song,YU Hua-Hua,GUO Zhan-Yong,WANG Pi-Bo(中国科学院海洋研究所,青岛,266071;中国科学院研究生院,北京), 李智恩,李鹏程,LI Zhi-En,LI Peng-Cheng(中国科学院海洋研究所,青岛,266071)应用化学

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