快速纯化DNA聚合酶
细菌培养：
选取单个菌落在LB（含有Amp 80ug/mL）培养基中过夜培养。
接种500uL 过夜培养物到750 mL LB（含有Amp 80ug/mL）培养基中在2000mL 培养瓶中。总共培养3×750mL。
37℃ 培养12小时到OD600=0.8 摇床速度为不低于200rpm。
加入IPTG(储存浓度为100mM)至终浓度为0.5mM，大约需要10 mL IPTG
继续培养10小时，不要超过12小时。
收获细菌：
在GS3转子在5000rpm 离心20分钟，弃上清。
用buffer A 每管加入100mL 洗涤细菌沉淀。
buffer A配方：50mM Tris-HCL,pH7.9
50mM dextrose（葡萄糖）
1mM EDTA
3．5000rpm 离心细菌
裂解细菌：
制作新鲜前裂解buffer(BufferA + 4mg/mL 融菌酶)
在每个离心管中加入50mL 前裂解buffer 重悬细菌，细菌应该完全重悬，不应该有团块。
室温下孵育15分钟。
加入相等体积的裂解buffer(lysis buffer)，其配方为：
20mM Tris-HCL,pH7.9;50
50mM KCL
1mM EDTA
1mM PMSF
0.5% Tween 20
0.5% NP40
如果配置100mL( Tris-HCL 2mL；KCL 5mL； 0．2mL EDTA； PMSF 0.2mL
10% Tween 20 5mL;10% NP40 5 mL)
很好的混匀，溶菌液将是黏性的。
将所有的溶菌液转移到1－2个塑料瓶中
孵育全部200mL 裂解液在75℃水浴1 小时。
分离Tag酶；澄清裂解混合物：
1．4℃ 15000rpm 离心10 分钟
2．将上清加到SW28 转子 超速离心管中（35mL/管）
3．4℃ 26000rpm 离心45分钟（注意超离这步可以不作如果能看到1离下来沉淀）
硫酸铵沉淀：
转移澄清的裂解产物大约200mL 到一个干净的瓶子。
每一百毫升裂解产物慢慢加入30g硫酸铵粉末，在室温下快速搅动。硫酸铵的用量大约为50－60g，依赖于裂解产物的体积。
加入一半的硫酸铵后透明的裂解产物变成牛奶状，4℃ 15000rpm 离心10 分钟
收获蛋白沉淀
重悬蛋白沉淀，每100mL 最初的裂解产物用20 mL buffer B 重悬。
Buffer B 配方：
50mM Tris-HCL,pH7.9;
50mM KCL
0．1mM EDTA
1mM DTT
0.1mM PMSF
两步透析：
在buffer C中透析12 小时。50mM Tris-HCL,pH7.9;
50mM KCL
0．1mM EDTA
1mM DTT
配方：
Buffer C
0.5mM PMSF
2．第一次透析后，一定会有沉淀，这时4℃ 15000rpm 离心30 分钟，来澄清第一次透析产物。
3．重新将上清装入透析袋，在储藏透析缓冲液中过夜。这时你能浓缩Tag酶3倍。
储藏透析缓冲液配方：buffer C＋50％甘油
用商品Tag酶来测定你制作的Tag酶活性：
注意：
大肠杆菌菌株：INF alpha F
过渡培养的细菌导致Tag酶降解。
纯化蛋白的过程：
诱导提蛋白：600ml重组菌+600μl IPTG诱导2.5h，6000rpm离心10分钟后冻存。
1．细胞以每克湿重2-5ml裂解缓冲液重悬。
2．加入溶菌酶(50mg/ml)至终浓度1mg/ml，冰浴30min。
3．冰上超声。10秒+10 6个循环，300W，用小超声头。
4．若裂解液粘稠，加入RNase A (10μg/ml)和DNase I (5μg/ml)冰浴10~15min。
5．1000g离心20~30min (4℃)，取上清。(上清留样电泳)
6．将1ml 50%，Ni-NTA匀浆于4ml澄清裂解液中，于200rpm旋转摇床轻摇混匀，4℃, 60min。
7．将裂解液-Ni-NTA混和物上柱。
8．取流出液电泳分析。
9．以4ml wash buffer洗两次，留样电泳分析。
10．以0.5ml elution buffer洗脱蛋白4次，于四个tube收集，电泳分析。
(1) lysis buffer：(buffer A) (1L) pH=8.0 用NaOH调
50mM NaH2PO4 7.8g NaH2PO4.2H2O (156.01) 6.9g NaH2PO4.H2O (137.99)
300mM NaCl 17.54g NaCl (58.44)
10mM imidazole 0.68g imidazold (68.08) (实配1mM)
(2) wash buffer: (buffer B) (1L) pH=8.0
50mM NaH2PO4 7.8g NaH2PO4.2H2O
300mM NaCl 17.54g NaCl
20mM imidazole 1.36g imidazole (实配1mM)
(3) elution buffer: (buffer C) (1L) pH=8.0
50mM NaH2PO4
300mM NaCl
250mM imidazole 17.00g
(4) buffer A B C成份可根据特殊情况稍作修改，imidazole含量可根据蛋白与柱结合情况调整，(A中)结合弱可1-5mM，结合强可20mM。可加入0.1% Tween，5~10mM β-ME，1mM PMSF或增加NaCl，甘油离心。
(5) 使用完以10倍体积0.2M乙酸，30%甘油和水依次清洗，保存于30%乙醇中防微生物生长。
Ni-NTA活化：推荐5次/柱，若由浅兰变棕灰，则再生如下：建议流速0.5ml/min。
1．以2倍体积的再生缓冲液清洗 (6M GuCl，0.2M acetic acid)
2．以5倍体积的H2O冲洗。
3．3倍体积的2% SDS冲洗。
4．1倍体积25%乙醇洗。
5．1倍体积50%乙醇洗。
6．1倍体积.75%乙醇洗。
7．5倍体积100%乙醇洗。
8．1倍体积.75%乙醇洗。
9．1倍体积50%乙醇洗。
10．1倍体积25%乙醇洗。
11．1倍体积水清洗。
12．5倍体积100mM EDTA (pH 8.0)洗。
13．水洗。
14．2倍体积100mM NiSO4洗。
15．2倍体积水洗。
16．2倍体积再生缓冲液洗。
17．2倍体积buffer A或B平衡。
18．30%乙醇与beads等体积保存于4℃。
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