IGF-1诱导神经干细胞向少突胶质细胞分化的机制研究

IGF-1诱导神经干细胞向少突胶质细胞分化的机制研究

王 军 刘增良 秦向英 刘 洋 于海明

（齐齐哈尔医学院附属第二医院 神经外科 黑龙江 齐齐哈尔 161000）

【摘 要】探索胰岛素样生长因子（IGF）-1诱导大鼠脊髓源性神经干细胞向少突胶质细胞方向分化的机制。方法：本研究采用Western印迹和RT-PCR方法，检测分化的神经干细胞（NSCs）中抗磷酸化细胞外信号调节激酶（ERK） 1/2 蛋白磷酸化的情况，以及ERK 1/2 特异性抑制剂PD98059对c-fos、c-jun表达的产生的影响。结果：胰岛素样生长因子开始表达后，NSCs中磷酸化的ERK 1/2 表达量逐渐增加，它的特异性抑制剂 PD98059能够有效阻断这种增高作用，转录因子c-fos、c-jun的表达以及对特异性抑制剂 PD98059的反应和ERK的变化保持一致。结论：MAK-ERK信号途径在NSCs向少突胶质细胞转化的过程中起着重要作用。

【关键词】神经干细胞；胰岛素样生长因子-1；少突胶质细胞

【中图分类号】R329 【文献标识码】B 【文章编号】1004-597X（2016）22-0016-011.材料与方法1.1 材料

本实验使用的DMEM/F12（1：1）培养基以及B27无血清培养添加剂来自Gibco公司；脂质体2000和ERK 购买自Invitrogen公司；从TAKARA公司购买的RT-PCR试剂盒；从Promega公司购买的ERK特异性抑制剂PD98059；由吉林大学动物室提供的新生24h内的Wistar大鼠（SPF级）；实验室自行构建并保存重组载体pcDNA3.1-GFP-IGF。

1.2 方法

1.2.1 分离NSCs

采用断颈法处死新生的Wistar大鼠，进行无菌处理，取出大鼠的脊柱，细胞分离采用机械方法。DMEM/F12（1：1）培养基为实验中使用的基础培养基，使用1%浓度的B27无血清培养添加剂、20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）以及20ng/ml的重组人表皮生长因子，将细胞的浓度调节为2×105。将调节好浓度的细胞接种到平皿上，培养温度保持在37℃，CO2浓度为5%。

1.2.2 使NSCs转染IGF-1基因

将NSCs接种到6孔培养板上继续增殖培养，当细胞贴壁生长量达到60%～70%时开始转染IGF-1基因。转染过程一般采用常规脂质体法转染重组质粒pcDNA3.1-GFP-IGF-1。2天之后，将细胞消化传代到平皿中，用DMEM/F12完全培养基（G418含量为600μg/ml）进行筛选，筛选得到的细胞用DMEM/F12完全培养基（G418含量为300μg/ml）进行培养。

1.2.3 IGF-1基因对NSCs ERK 1/2蛋白磷酸化的影响

转染了IGF-1基因之后，NSCs 中ERK 1/2蛋白磷酸化的情况可以通过观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况来确定。研究中将NSCs开始表达的时间记为0h，提取细胞的蛋白质，之后分别提取0.5h、1h、2h和4h时细胞的蛋白质。以5组蛋白质作为样本，使用Western印迹法来检测ERK 1/2蛋白磷酸化的情况，研究过程要借助荧光显微镜进行观察。

1.2.4 IGF-1基因对转录因子c-fos、c-jun和c-myc表达的影响

实验过程中将NSCs开始表达IGF-1基因的时刻记为0h，提取此时刻细胞的RNA，按照相同的方法，分别提取5组细胞在0.5h、1h、2h、4h四个时刻的RNA。IGF-1基因对转录因子表达情况的影响可以使用RT-PCR方法进行研究，实验中要对每种转录因子的表达情况进行详细记录和比较。

1.2.5 ERK 1/2特异性抑制剂PD98059对转录因子c-fos、c-jun表达的影响

IGF-1开始表达时，将特异性抑制剂PD98059加入到NSCs细胞的培养液中去，抑制剂浓度为20μmol/L，1小时之后提取

NSCs的RNA，同样使用RT-PCR方法对转录因子的表达情况进行研究。

2.结果

2.1 IGF-1对表达了IGF-1的NSCs的ERK 1/2磷酸化产生的影响

处于分化状态的NSCs开始表达IGF-1，利用Western印迹法对ERK 1/2蛋白的磷酸化情况进行检测，检测结果显示，2h之前，磷酸化的ERK 1/2量与时间成正比，2h时表达量达到峰值，2h之后，磷酸化的ERK 1/2量逐渐下降。

2.2 IGF-1基因对转录因子c-fos、c-jun和c-myc表达产生的影响

使用RT-PCR检测5组提取RNA中c-fos、c-jun和c-myc的表达情况可以发现，转录因子c-fos和c-jun的mRNA表达水平在初期有明显上升趋势，而c-myc在各个时间点没有明显差别。

2.3 ERK 1/2特异性抑制剂PD98059对c-fos、c-jun表达的影响分析

使用RT-PCR检测加入特异性抑制剂PD98059后转录因子的表达情况，检测结果发现，抑制剂对c-fos、c-jun的mRNA表达具有明显的抑制作用。

3.讨论

少突胶质细胞在中枢神经系统中至关重要，有助于神经元之间的信号传导。在中枢神经系统中，少突胶质细胞的存在可以包绕着轴突，形成髓鞘结构，对神经元功能的正常发挥提供保障。NSCs具有强大的分化功能，因此可以分化成少突胶质细胞，如何诱导其定向分化成少突胶质细胞有待探索。

IGF-1是一种促生长因子，其分子结构与胰岛素十分类似，是一种多肽蛋白物质。相关研究发现，IGF-1的合成与代谢贯穿人体生长发育的全过程，对人体的生长发育有着至关重要的调节作用，能够促进突触、髓鞘的形成，能够提高神经细胞的分化和发育，还能够促进少突胶质细胞以及髓鞘的生长。前期进行的试验研究证明，转染了IGF-1的NSCs能够分化成少突胶质细胞，考虑到ERK在细胞生长周期中的重要作用，本研究探索转染了IGF-1的NSCs如何定向转化为少突胶质细胞，并分析这一过程中的影响因素。

参考文献

[1]张殿君，付长峰，张利恒.IGF-1诱导神经干细胞向少突胶质细胞分化的机制[J].中国老年学杂志，2011，31（23）：4595-4597.

[2]朱树干，迟令懿，王旭平.胰岛素样生长因子-1诱导神经干细胞向少突胶质细胞分化研究[J].中华实验外科杂志，2006，32（1）：1450-1451.

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