日本对虾β-actin基因的克隆表达与纯化

第２８卷第２期　泉州师范学院学报（自然科学）　Ｖｏ１．２８　Ｎｏ．２　２０１０年３月　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｑｕａｎｚｈｏｕ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）　Ｍａｒ．２Ｏ１０　日本对虾ｆｌ－ａｃｔｉｎ基因的克隆表达与纯化　吴文林，许婉芳，戴聪杰　（泉州师范学院化学与生命科学学院，福建泉州　３６２０００）　摘　要：利用ＲＴ－ＰＣＲ技术从日本对虾中克隆到￣ａｃｔｉｎ基因的ｃＤＮＡ，通过双酶切将其克隆到原核表达载　体ｐＧＥＸ－４Ｔ－２中，转化大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１感受态细胞，获得阳性克隆．４℃下ＩＰＴＧ诱导表达，Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ纯化后获得高纯度的ｆｌ－ａｃｔｉｎ蛋白．　关键词：ＰＣＲ；日本对虾；￣ａｃｔｉｎ；表达；纯化　中图分类号：Ｑ５７５　．１２　文献标识码：Ａ　文章编号：１００９—８２２４（２０１０）０２—００５６—０３　肌动蛋白（ａｃｔｉｎ）是真核细胞中所发现的最保守的蛋白，它几乎参与了真核细胞的所有生理过程，如维持　细胞骨架结构完整性、细胞分裂、细胞分化、染色体运动、细胞器运动、细胞激化、胞质流动等［１　３］．肌动蛋白有　６种不同的异构体，根据不同的等电点，分别称之为　、７肌动蛋白．　一肌动蛋白作为一种细胞质肌动蛋白，是　细胞骨架的重要组成部分，是最主要的非肌肉或胞质肌动蛋白异型体，在真核生物的大多数非肌肉细胞以及　未分化的成肌细胞中表达　．ｐ－ａｃｔｉｎ除有基因序列高度保守的特征外，还具有ｍＲＮＡ的表达数量高和表达稳　定的特点，它与一些管家基因一样在生物体内持续衡量表达，因而在很多需量化的实验技术，如ＲＴ－ＰＣＲ，ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ中被当作内参照　．　对虾是热带、亚热带浅海最占优势的甲壳动物，具有种类多、种群数量大、繁殖力强、生长迅速、肉味鲜美　等特点．我国养虾业自８Ｏ年代以来迅速发展，１９８８年产量达２Ｏ万吨，２００２年达到了约４Ｏ万吨，居世界第一．　对虾养殖业已成为一个重要产业，成为我国沿海农民主要的收入来源．日本对虾（Ｐｅｎａｅｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）是当前　我国对虾养殖品种的主要品种之一．近年来由于养殖病害的大量出现，对虾的免疫研究逐渐成为水产研究的　热门领域［８　，在对免疫相关基因的研究中，￣－ａｃｔｉｎ成为研究基因表达水平的主要参照基因．　１材料与方法　１．１材料　ＴＲＩｚｏｌ为Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品；限制性内切酶、ＰＣＲ扩增试剂盒、Ｍ—ＭＬＶ　ＲＴ反转录试剂盒为ＴａＫａＲａ　公司产品；质粒ＤＮＡ提取试剂盒和胶回收试剂盒购自Ｏｍｅｇａ公司；Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ购自ＧＥ公司；　ＩＰＴＧ购自Ｓｉｇｍａ公司；ＰＣＲ引物由上海生工合成；其他试剂为国产分析纯．　．　１．２方法　１．２．１　对虾组织总ＲＮＡ的提取　在液氮中将１００　ｍｇ对虾组织研磨成粉末，在液氮尚未完全挥发时，将粉　末转移到１．５　ｍＬ的Ｅｐｐｅｎｄｏｌｆ管中，加入１　ｍＬ的ＴＲＩｚｏｌ，用研棒研磨１　ｍｉｎ，加入２００　Ｌ氯仿，剧烈振荡混　匀３０　Ｓ，４℃下１２　０００　ｒ・ｍｉｎ　离心１０　ｍｉｎ．将上清液转移到ＲＮａｓｅ—ｆｒｅｅ离心管里，加入等体积的异丙醇，室　温下放置５　ｒａｉｎ，４℃下１２　０００　ｒ・ｍｉｎ　离心１２　ｍｉｎ，小心移去上清液，防止ＲＮＡ丢失，用７Ｏ　酒精洗涤两　次，每次７００　Ｌ，１２　０００　ｒ・ｍｉｎ　离心２　ｍｉｎ，尽可能吸去上清液，防止ＲＮＡ沉淀丢失，放在室温下使酒精完　全挥发，将沉淀溶于３Ｏ～５０　Ｌ　ＤＥＰＣ－Ｈ。Ｏ．　１．２．２　总ＲＮＡ的逆转录　将４　ｇ总ＲＮＡ与１　Ｌ　Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）（５ＯＯ，ｕｇ・ｍＬＩ１）放入一ＲＮａｓｅ—ｆｒｅｅ的Ｅｐｐｅｎ一　收稿日期：２００９一儿一２３　作者简介：吴文林（１９６９一），男，福建漳州人，副教授，博士，从事海洋生物分子生物学研究　基金项目：福建省高校服务海西建设重点项目（Ａ１０１）；福建省教育厅项目（ＪＫ２ＯＯ９Ｏ４３）　５８　泉州师范学院学报（自然科学）　２０１Ｏ年３月　用锥形瓶摇培４００　ｍＬ重组菌，在４℃经ＩＰＴＧ诱导４　ｈ后离心　１　２　３　４　５　６　收集菌体，重悬于２Ｏ　ｍＬ的１×ＰＢＳ，超声波破碎，１０　０００　Ｘ　ｇ离心１５　ｌ１６　ｋｕ　ｍｉｎ，收集上清，与用１　Ｘ　ＰＢＳ平衡后的Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ介质　６６　ｋｕ　～　混合，室温轻摇３０　ｍｉｎ，上柱，用１Ｏ倍柱床体积的１ｘＰＢＳ洗柱，直到　４５　ｋｕ　流出液的０Ｄ２。。接近于零后，用还原型谷胱甘肽洗脱，收集洗脱液．纯　化的重组蛋白进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，结果表明获得了纯度很高的重　３３　ｋｕ　组融合蛋白（见图２），其中，１为蛋白Ｍａｒｋｅｒ，２为非重组菌株未经　２５　ｋｕ－　ＩＰＴＧ诱导，３为非重组菌株经ＩＰＴＧ诱导，４为重组菌株未经ＩＰＴＧ　诱导，５为重组菌株经ＩＰＴＧ诱导，６为经亲和层析纯化的　图２　￣－ａｃｔｉｎ在Ｅ．ｃｏｌｉ中的表达和纯化　ＧＳＴ－￣－ａｃｔｉｎ蛋白．　３　讨论　细胞浆ｆｌ－ａｃｔｉｎ基因的ｍＲＮＡ为丰富的转录本，并在所有组织中相对衡量、持续表达，因而成为ＲＴ－ＰＣＲ　和杂交技术最常用的对照基因．虽然在哺乳动物研究中也常有人采用ＧＡＰＤＨ和核糖体等作为内参照［１　］，　但作为一种成熟的参照系统，在无脊椎动物分子生物学的研究中，ｆｌ－ａｃｔｉｎ基因仍然是最常用的内参照基因．　肌动蛋白在研究基因的表达水平时也成为蛋白参照．本研究克隆表达的ｆｆａｃｔｉｎ蛋白可用于制备多克隆抗体，　作为研究对虾蛋白质表达水平的参照．在诱导表达时，发现ｆｌ－ａｃｔｉｎ蛋白的表达水平很高，很快形成包涵体，因　此采用降低诱导温度，在４℃诱导４　ｈ，在这样的条件下，虽然大部分蛋白形成包涵体，但有少部分可溶，通过　亲和层析纯化可获得高纯度的ｆｌ－ａｃｔｉｎ蛋白．　参考文献：　［１］ＰＯＬＬＡＲＤ　Ｔ　Ｄ，ＣＯＯＰＥＲ　Ｊ　Ａ．Ａｃｔｉｎ　ａｎｄ　ａｃｔｉｎ—ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ　ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｂｉｏ—　ｃｈｅｍ，１９８６，５５：９８７－１０３５．　［２３　ＫＡＢＳＣＨ　Ｗ，ＶＡＮＤＥＫＥＲＣＫＨＯＶＥ　Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｃｔｉｎ［Ｊ］．Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｂｉｏｍｏｌ　Ｓｔｒｕｃｔ，１９９２．２１：４９—７６．　［３］　ＣＨＡＤＷＩＣＫ　Ｂ　Ｐ，ＭＵＬＬ　Ｊ，ＨＥＬＢＬＩＮＧ　Ｌ　Ａ，ｅｔ薹■　　ａ１．Ｃｌｏｎｉｎｇ。ｍａｐｐｉｎｇ，ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｎｏｖｅｌ　ａｃｔｉｎ　ｇｅｎｅｓ，ａｃｔｉｎ－ｌｉｋｅ２７Ａ　（ＡＣＴＬ７Ａ）ａｎｄ　ａｃｔ二事黧　ｉｎ－ｌｉｋｅ２７Ｂ（ＡｃＴＬ７Ｂ），ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｆａｍｉｌｉａｌ　ｄｙｓａｕｔｏｎｏｍｉａ　ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｎ　９ｑ３１［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９９，５８（３）：３０２－３０９．　［４］　ＷＯＬＦＧＡＮＧ　Ｗ，ＬＩＮ　ｚ　Ｙ，ＬＩＮＬＩＡＮＡ　Ｄ　ｚ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅｆｌ－ａｃｔｉｎ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，１９８９，２６４（１０）：９５３９—９５４６．　［５］　ＢＬＩＴＶＩＣＨ　Ｂ　Ｊ，ＢＬＡＩＲ　Ｃ　Ｄ，ＫＥＭＰＦ　Ｂ　Ｊ，ｅｔ；叠　～Ｉ薰　　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１　ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ　ｆｒｏｍＡｅｄｅｓ　ｔｒｉｓｅｒｉａｔｕｓ　ｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ［Ｊ］．Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，２００２，１１（５）：４３１－４４２．　［６３　ＦＥＳＴＵＣＣｌ—ＢＵＳＥＬＬＩ　Ｒ　Ａ，ＣＡＲＶＡＬＨＯ—ＤＩＡＳ　Ａ　Ｓ，ＤＥ　ＯＬＩＶＥＩＲＡ—ＡＮＤＲＡＤＥ　Ｍ．ｅｔ　ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｙｐ６ｇｌ　ａｎｄ　Ｃｙｐｌ２ｄｌ　ｉｎ　ＤＤＴ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ａｎｄ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏ—ｇａｓｔｅｒ［Ｊ］．Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，２００５，１４（１）：６９—７７．　［７］　ＶＡＳＣ０ＴＴ０　ＳＧ，ＢＥＵＧ　Ｓ，ＬＩＶＥＲＳＡＧＥＲＡ，ｅｔ　ａ１．Ｎｖｂｅｔａ－ａｅｔｉｎ　ａｎｄＮｖＧＡＰＤＨ　ａｓ　ｎｏｒｍａｌｉ—ｚａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｆｏｒｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓｉｎ　ｌｉｍｂ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｓ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｂｌａｓｔｅｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｄｕｌｔ　ｎｅｗｔ，Ｎｏｔｏｐｈｔ　ｈａｈｎｕｓ　ｖｉｒｉｄｅｓｃｅｎｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｄｅｖ　Ｂｉｏｌ，２００５，４９（７）：８３３－８４２．　［８］　ＷＵ　Ｗ　Ｌ，ＷＡＮＧ　Ｌ，ＺＨＡＮＧ　Ｘ　Ｂ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｗｈｉｔｅ　ｓｐｏｔ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｖｉｒｕｓ（ＷＳＳＶ）ｅｎｖｅｌｏｐｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｓｈｒｉｍｐ　ｉｎｆｅｅ－　ｔｉｏｎＥＪ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ。２００５，３３２：５７８—５８５．　［９］　ＬＩ　Ｈ　Ｘ，ＭＥＮＧ　Ｘ　Ｌ，ＸＵ　Ｊ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｒａｙｆｉｓｈ，Ｃａｍｂａｒｕｓ　ｃｌａｒｋｉｉ，ｆｒｏｍ　ｗｈｉｔｅ　ｓｐｏｔ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｖｉｒｕｓ　ｂｙ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ａ　ｖｉｒａｌ　ｅｎｖｅｌｏｐｅ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ｆｉｓｈ　Ｄｉｓ，２００５，２８（５）：２８５—２９１．　［１０３　魏克强，许梓荣．家蚕蛹表达的重组ＶＰ２８疫苗对克氏原螯虾的抗病毒保护效应口］．实验生物学，２００５，３８（３）：１９０—１９８．　［１１］　ＮＡＭｌＫＯｓｊｌ　Ａ，ＷＵ　Ｊ　Ｌ，ＹＡＭＡＳＨＩＴＡ　Ｔ，ａｔ　ａ１．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ　ｔｒｉａｌｓ　ｗｉｔｈ　Ｐｅｎａｅｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　ｔｏ　ｉｎｄｕｃｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ｗｈｉｔｅ　ｓｐｏｔ　ｓｙｎ—　ｄｒｏｍｅ　ｖｉｒｕｓＥＪ］．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，２００４，２２９：２５—３５．　●　［１２］　ＡＴＴＡＳＡＲＴ　Ｐ。ＫＡＥＷＫＨＡＷ　Ｒ，ＣＨＩＭＷＡＩ　Ｃ．ｅｔ　ａ１．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｗｈｉｔｅ　ｓｐｏｔ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｖｉｒｕｓ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｐｅｎａｅｕｓ　ｍｏｎｏｄｏｎ　ｂｙ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ｖｉｒａｌ　ｒｒ２　ａｎｄ　ｓｈｒｉｍｐ　ＰｍＲａｂ７［Ｊ］．Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ，２００９，１４５（１）：１２７—１３３．　［１３］　ＺＨＡＮＧ　Ｙ，ＳＯＮＧ　Ｌ，ＺＨＡＯ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＣｐＧ　ＯＤＮｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｗｈｉｔｅ　ｓｐｏｔ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ—　ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖｉｒｕｓ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎｄｉｒｅｃｔｌｙ　ｉｎＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ　ｖａｎｎａｍｅｉ［Ｊ］．Ｄｅｖ　Ｃｏｍｐ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１０，３４（４）：４１８－４２４．　［１４］　徐皓，陈涛，王海权，等．ＩＬ２１２ｐ３５　ｓｉＲＮＡ干涉对大鼠髓源性树突状细胞表面分子表达的影响［Ｊ］．南京医科大学学报，２００６，２６　（７）：５２３－５２５．　［１５］　ＳＵＺＵＫＩ　Ｔ，ＨＩＧＧＩＮＳ　Ｐ　Ｊ。ＣＲＡＷＦＯＲＤ　Ｄ　Ｒ．Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ＲＮＡ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０００，２９（２）：３３２－３３７．　（下转第７９页）　第２期　杨昔阳，等：基于因子分析和变权综合的学习成绩评价方法　７９　地加强学生的某种能力以提高学科成绩．　值得注意是，当考试成绩缺乏统计规律，从而导致提取的因子不能很好地被解释成某种能力时，因子总得　分的含义往往是模糊不清的，此时应当慎用这种评价方法．　参考文献：　［１］叶宗裕．高考成绩综合时的标准分研究ＥＪ］．统计与决策，２００５（５）：２５—２６　Ｅ２］魏春玲，孙晋海．中外优秀十项全能运动员成绩结构的因子分析及回归预测模型研究［Ｊ］．北京体育大学学报，２００４，２７（５）：６５３—６５５　［３］张星月．基于因子分析和聚类分析的教学成绩分析方法ＥＪ］．潍坊学院学报，２００８，８（４）：９１—９３．　［４］汪培庄．模糊集与随机集落影［Ｍ］．北京：北京师范大学出版社，１９８５．　［５］李洪兴．因素空间理论与知识表示的数学框架（ＶＩＩＩ）［Ｊ］．模糊系统与数学，１９９５，９（３）：１－９．　［６］李德清，戴敦敬．一种基于变权的人才选优决策模型［ｊ］．大学数学，２００５，２１（２）：１２８—１３１．　Ｅ７］杨昔阳，曾丽雪．合理变权的层次分析模型［Ｊ］．泉州师范学院学报，２００９，２７（２）：１８—２４．　Ｓｃｏｒｅ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　Ｖａｒｉａｂｌｅ　Ｗｅｉｇｈｔ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ　ＹＡＮＧ　Ｘｉ—ｙａｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｐｉｎｇ～ｈｕａ，Ｈ　ＵＡＮＧ　Ｗｅｉ＿ｊ　ｉｎｇ　（Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍａｔｈｍａｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｑｕａｎｚｈｏｕ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｊｉａｎ　３６２０００，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｗａｙ　ｆｏｒ　ｓｃｏｒｅ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｉｓ　ｐｒｏｐｏｓｅｄ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｗｅｉｇｈｔ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ，ａｎｄ　ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｓｔｕｄｅｎｔｓ’ｓｃｏｒｅｓ　ｉｎ　Ｘｉａｍｅｎ　Ｈａｉｃａｎｇ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｓｃｈｏｏｌ　ｆｏｒ　ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｓ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｐｒｏｐｏｓｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ａｂｌｅ　ｔｏ　ｆｉｎｄ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｔｈａｔ　ｈａｖｅ　ｄｉｒｅｃｔ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ　ｏｎ　ｓｃｏｒｅｓ，ａｎｄ　ｔｏ　１ｉｓｔ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｅｎｔｓ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｂａｌａｎｃｅ　ｏｆ‘ｆａｃｔｏｒｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｓｃｏｒｅ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ；ｆａｃｔｏｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ；ｖａｒｉａｂｌｅ　ｗｅｉｇｈｔ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ　卜幸｝＿—＊　＊　．｝—＊＊＊＿｛｛一静＊廿＊＊幸卜＊＊｛千｛ｌ卜｛＋＊廿＿｛｝斗｝＊｛卜＊｛÷－Ｍ－｛｝－Ｉ￣＊＊　ｑ４－＿｛Ｈｌ卜　（上接第５８页）　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｕｒｉ　ｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ＃ａｃｔｉｎ　ｏｆ　Ｐｅｎａｅｕｓ　Ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　ＷＵ　Ｗｅｎ—ｌｉｎ，ＸＵ　Ｗａｎ—ｆａｎｇ，ＤＡＩ　Ｃｏｎｇ－ｊ　ｉｅ　（Ｓｃｈｏｏ１　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｑｕａｎｚｈｏｕ　Ｎｏｒｍａ１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｊ　Ｊａｎ　３６２０００，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：［￣ａｃｔｉｎ　ｏｆ　Ｐｅｎａｅｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ｂｙ　ＲＴ—ＰＣＲ　ａｎｄ　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐＧＥＸ一４Ｔ一２　ｐｌａｓｍｉｄ．　Ｔｈｉｓ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２　１．Ａｆｔｅｒ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｗｉｔｈ　ＩＰＴＧ　ａｔ　４℃，ｔｈｅ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＰＣＲ；Ｐｅｎａｅｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ；　ａｃｔｉｎ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ