肿瘤坏死因子受体2编码基因重组质粒的构建及意义

・　７１２　・　主里垫　量　至　旦釜！　鲞箜　塑　ｈｉ　Ｒｅｍｅｄｉｅｓ＆Ｃｌｉｎｉｃｓ，Ｊｕｎｅ　２０１２，Ｖｏ１．１２，Ｎｏ．６　肿瘤坏死因子受体２编码基因重组质粒的　构建及意义　卫娜　白瑞车星星王泽慧　肖传实边云飞　【摘要】　目的构建真核表达质粒ｐｃＤＮＡ６．０一ＴＮＦＲ２－　和ｐｃＤＮＡ６．０一ＴＮＦＲ２１９６ＡＲＧ。方法人工合成　ＴＮＦＲ２１９６ＭＥＴ目的片段，与ｐＭＤ１８一Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ载体连接形成克隆载体，再通过设计突变引物，ＰＣＲ定点突变扩增　出含有突变位点的质粒，转化到肠埃希菌感受态细胞ＪＭ１０９中。通过氨苄青霉素抗药性筛选出成功转化的阳性　克隆，并进行扩增。抽提质粒进行测序鉴定，得到ｐＭＤ１８一Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ—ＴＮＦＲ２　ＦＲ２１９６ＭＥＴ、ｐＭＤ１８一Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ—ＴＮＦＲ２　菌液ＰＣＲ和双酶切及测序鉴定。结果功。结论及ｐｃＤＮＡ６．０，将ＴＮＦＲ２　、ＴＮＦＲ２　构建成ｐｃＤＮＡ６．０一ＴＮＦＲ２－一和ｐｃＤＮＡ６．０一ＴＮＦＲ２　。双酶切ｐＭＤ１８一Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ—ＴＮ—　插入ｐｃＤＮＡ６．０线性质粒．即　真核表达质粒，转化到Ｅｃｏ｜ｉ感受态中，筛选阳性克隆行　酶切鉴定和测序分析验证ＴＮＦＲ２基因１９６Ｍ￣ｘ和１９６ＡａＣ表达载体构建成　成功构建表达载体为下一步心血管疾病研究奠定了实验基础。　【关键词】受体，肿瘤坏死因子，Ⅱ型；突变；遗传载体；心血管疾病　Ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　２　ｇｅｎｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｌａｓｍｉｄ：ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ＷＥＩ　Ｎ　．ＢＡＩ　Ｒｕｉ，ＣＨＥ　Ｘｉｎｇ－ｘｉｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｚｅ—ｈｕｉ，ＸＩＡ０　Ｃｈｕａｎ—ｓｈｉ，ＢＩＡＮ　Ｙｕｎ－ｆｅｉ．＊Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃａｒｄｉｄｌｏｇｙ，　Ｓｈａｎｘ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｙｕａｎ　０３０ＨＤ０１．Ｃｈｉｎａ　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｔｈｅ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｌａｓｍｉｄ，ｐｃＤＮＡ６．０－ＴＮＦＲ２　ＴＮＦＲ２，￣Ｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＴＮＦＲ２　ａｎｄ　ｐｃＤＮＡ６．０一　ｔａｒｇｅｔ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｗａｓ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ａｎｄ　ｗａｓ　ｌｉｎｋｅｄ　ｔｏ　ｐＭＤ１８一Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ　ｏｒ　ｆｆｏｒｍｉｎｇ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｔｈｉｓ　ｗａｓ　ｆｏｌｌｏｗｅｄ　ｂｙ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｗｉｔｈ　ｐｏｉｎｔ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｌｎａ—　ｔｉｏｎ　ｉｎｔｏ　ＪＭ１０９．ｔｈｅ　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌ　ｃｅｌｌｓ，ｖｉａ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｂａｓｉｓ　ｏｆ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ．Ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｌｏｎｅｓ　ｖｉａ　ｔｒａｎｓｏｆｒｍａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ａｎｄ　ｗｅｒｅ　ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｐＭＤ１８一Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ—ＴＮＦＲ２　ｐＭＤ　ｌ　８一Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ—ＴＮＦＲ２　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｔｈｅ　ｐｌａｓｍｉｄｓ，　．ｐＭＤ１８．Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ—ＴＮＦＲ２１９６Ａ　ａｎｄ　ｐｃＤＮＡ６．０。ｕｎｄｅｒｗｅｎｔ　ｄｏｕｂｌｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．Ｂｏｔｈ　ＴＮＦＲ２＇９６￣ａｎｄ　ＴＮＦＲ２　９６　０　ｗｅｒｅ　ｔｈｅｎ　ｉｎｓｅｒｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐｃＤＮＡ６．０．ｔｈｅ　ｌｉｎｅａｒ　ｐｌａｓｍｉｄ．ｆｏｒ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘ—　ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ．ｐｃＤＮＡ６．０．ＴＮＦＲ２　ａｎｄ　ｐｃＤＮＡ６．０一ＴＮＦＲ２‘　．ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　ｃｏｍ—　ｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｆｏｌｌｏｗｅｄ　ｂｙ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｌｏｎｅｓ　ａｓ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｂｙ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ，ｄｏｕｂｌｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉ—　ｇｅｓｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｔｅｓｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＴＮＦＲ２　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｌａｓｍｉｄｓ．ｐｃＤＮＡ６．０一ＴＮＦＲ２　ａｎｄ　ｐｃＤＮＡ６．０一ＴＮ—　ＦＲ２’　ＲＧ．ｗｅｒｅ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．ａｓ　ｃｏｎｆｉｍｅｄ　ｂｙ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｒｎｇ　ａｎｄ　ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｃＤＮＡ６．０一ＴＮＦＲ２　ａｎｄ　ｐｃＤＮＡ６．０一ＴＮＦＲ２　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｈａｓ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ｏｕｎｄａｔｉｆｏｎ　ｆｏｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｉｓｅａｓｅｓ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ｔｕｍｒｏ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ，ｔｙｐｅ　ＩＩ；Ｍｕｔａｔｉｏｎ；Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｃｏｎｓｔｕｃｔｒｉｏｎ；Ｃａｒｄｉｏｖａｓ—　ｃｕｌａｒ　ｄｉｓｅａｓｅｓ　肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）是介导多向性炎症反应和　ＴＮＦＲ１相对分子质量５５　０００，ＴＮＦＲ２相对分子质量　免疫调节反应的细胞因子，具有广泛的生物学活性。　７５　０００，它们分别含有４５５个氨基酸和４６１个氨基　在免疫调节、抗病毒、炎症反应、内毒性休克以及某　些慢性病、恶液质性消瘦和营养不良综合征等细胞　反应中具有重要作用　］。ＴＮＦ产生的生物学活性是　通过存在于细胞表面的膜受体，即肿瘤坏因子受体　１（ＴＮＦＲ１）和肿瘤坏死因子受体２（ＴＮＦＲ２）介导。　基金项目：Ｌ【Ｊ西省科技攻关项目（２００９０３１　１０５７—４）　作者单位：０３０００１太原，山西医科大学第二医院心内科（卫娜、　白瑞、车星星、王泽慧、边云飞）；“Ｉ西省医科大学第一医院（肖传实）　通信作者：边云飞，Ｅｍａｉｌ　ｗｅｉｎａ８６０６０３＠１６３．ｃｏｒｎ　酸。研究证实其诱导的信号转导途径在冠心病慢性　炎症过程中起关键作用［５，　。ＴＮＦＲ２由肿瘤坏死因子　超家族成员１Ｂ基因（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）编码，ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ　基因位于染色体ｌｐ３６．２。由１０个外显子和９个内含　子组成，除外显子４、９、１０的非编码区ＳＮＰ外，最近　发现６号外显子１９６位（ｒｓ１０６１６２２位点核酸序列　６７６位）上有个单核苷酸多态（Ｔ／Ｇ）。我们通过大量　的病例对照研究对冠心病患者的ＴＮＦＲ２基因型分　析发现冠心病组ｒｓｌ０６１６２２位点ＧＧ基因型较对照　中国药物与ｌｌ台ｉ床２０１２年６月第　鲞箜　塑　堕垦　！　：　些　！　：　：　！　：　组差异有统计学意义［７］，所以本实验旨在构建真核　表达质粒ｐｃＤ　ＮＡ６．０．ＴＮＦＲ２　和ｐｃＤＮＡ　６．０一ＴＮ—　ｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　ＪＭ１０９。对平板上的菌落用Ｍ１３．４７／ＲＶ．Ｍ　引物进行ＰＣＲ。检测所含质粒中插人片段的长度大　小。最后提取质粒ＤＮＡ进行测序。其中Ｍ１３—４７：　５　．ＣＣＣＣＡＧＧＣＴＩ丫ＩＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ一３　，ＲＶ—Ｍ：　ＦＲ２１９６ＡＲＧ．为后续转染至细胞中进一步研究其功能提　供实验基础。　１材料与方法　１．１材料　１．１．１质粒和宿主菌：人工合成ｐＭＤ１８．Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ—　ＴＮＦＲ２１９６ＭＥＴ菌种购自日本ＴａＫａＲａ公司，真核表达　质粒ｐｃＤＮＡ６．０菌种由山西医科大学寄生虫教研室　王海龙老师惠赠，Ｅｃｏｌｉ感受态细胞ＪＭ１０９购自北京　天根生化科技有限公司。　１．１．２酶类及试剂：定点突变试剂盒ＴａＫａＲａ　Ｍｕ—　ｔａｎＢＥＳＴ　Ｋｉｔ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１０ｘＰｙｒｏｂｅｓｔ　ＢｕｆｆｅｒⅡ、ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ、１０ｘＢｌｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｎａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ、　Ｂｌｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｎａｔｉｏｎ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ、ｄｄＨ２Ｏ）、ＰＣＲ突变引　物购自日本ＴａＫａＲａ公司；胶回收试剂盒Ｇｅｌ／ＰＣＲ　ＤＮＡ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ购自台湾Ｇｅｎｅａｉｄ公　司；限制性内切酶Ｈｉｎｄ　１１和ＥｃｏＲ　Ｉ、Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇ—　ａｓｅ、１０ｘＢｕｆｆｅｒ　Ｒ、１０ｘＬｉｇａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ　公司；ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ、ＰＣＲ引物购自上海生工生物工　程有限公司：ＴＩＡＮｐｒｅｐ质粒小提试剂盒Ｍｉｎｉ　Ｐｌａｓ—　ｍｉｄ　Ｋｉｔ购自北京天根生化科技有限公司；胰蛋白　胨、酵母菌提取物、琼脂购自美国Ｓｉｇｍａ公司，氨苄　青霉素钠购自上海吉凯基因技术有限公司．．其他试　剂如溴化乙锭、硼酸等购自美国Ａｍｅｒｓｃｏ公司。　ＬＢ液体培养基：胰蛋白胨１０　ｇ，酵母提取物５　ｇ，ＮａＣ１　１０　ｇ，加ｄｄＨ：Ｏ至１　Ｌ，高压灭菌后４℃保存　备用；ＬＢ固体培养基：胰蛋白胨１０　ｇ，酵母提取物５　ｇ，ＮａＣｌｌ０　ｇ，琼脂粉１５　ｇ，加ｄｄＨ２Ｏ至１　Ｌ，高压灭　菌后冷却至６０℃加入氨苄青霉素钠使终浓度为　１００　Ｉ￣ｇ／ｍｌ。　１．２方法　１．２．１构建ｐＭＤ１８．Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ—ＴＮＦＲ２。％旧载体：Ｇｅｎ．　Ｂａｎｋ上查询出ＴＮＦＲ２基因编码区（ＣＤＳ区、）核苷酸　序列（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ＮＭ＿００１０６６），在基　因编码区起始密码子前和终止密码子后分别加上限　制性内切酶Ｈｉｎｄ　ｍ（ＡＡＧＣＴＴ）和ＥｃｏＲ　Ｉ　（ＧＡＡＴｒＣ）序列，共１３９８　ｂｐ。首先合成单链小片段　ＤＮＡ，再通过ＰＣＲ方法，把单链小片段ＤＮＡ拼接成　一条完整的双链ＤＮＡ片段。然后在微量管里进行　连接反应：Ｉｎｓｅ￣ＤＮＡ　２　ｌ，Ｖｅｃｔｏｒ　ＤＮＡ（ｐＭＤ１８．Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ）１　ｌ，ｄＨ２Ｏ　２　ｔｘｌ，Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｉ　５　ｌ，１６　ｃｃ保温３０　ｍｉｎ。将连接液全量转化至Ｅ－ｃｔ　ｌｉ　Ｃｏｍ．　５　．ＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡｒｒ】　ＣＡＣＡＣＡＧＧ．３　．测序引　物ｐＭＤ１８　Ｆ：５　一ＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＩ１ＡＣＧＣＣＡ一３　，Ｒ　５　一ＧＡＧｃＧＧＡＴＡＡｃＡＡＴＩ丫ｒｃＡｃＡｃＡＧＧ一３　。人工合　成ｐＭＤ　１　８．Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ．ＴＮＦＲ２　肿菌种由日本ＴａＫａＲａ　公司完成。　１．２．２构建ｐＭＤ１８．Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ。ＴＮＦＲ２　重组体：原　理是利用导入变异点１９６位卜Ｇ的引物进行ＰＣＲ　反应．对ＰＣＲ产物进行末端平滑化及５　磷酸化处　理，再用高效连接试剂Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｉ进行自身　连接（环化反应），然后转化、提取突变体ＤＮＡ。①设　计合成突变引物：设计合成突变引物。使得ＴＮＦＲ２　第１９６位甲硫氨酸转变为精氨酸。定点突变引物上　游：５＇－ＧＧＧＡＴＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＣＧＴＣＣ．３　（包含突变位　点），下游：５　一ＴＧＣ　ｒＴＣＣＡＴＴＣＣＣＡＧＧＧＡＴＧＧ一３　。②　定点突变聚合酶链反应：以ｐＭＤ１８一Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ．ＴＮ．　ＦＲ２　一质粒ＤＮＡ为模板进行定点突变ＰＣＲ扩增　ＰＣＲ反应液：Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５　Ｕ／ｔｚ１）０．２５　ｌ，１０ｘＰｙｒｏｂｅｓｔ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｉ１　５　ｌ，ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　４　ｌ，　Ｐｒｉｍｅｒ　１（２０　Ｉ￣ｍｏｌ／Ｌ）１　Ｉｘｌ，Ｐｒｉｍｅｒ　２（２０￣ｍｏｌ／Ｌ）１　ｌ，Ｔｅｍｐｌａｔｅ　３．８２　ｔｘｌ，灭菌蒸馏水５Ｏ　ｌ。９４℃３０　Ｓ，　５８℃３０　Ｓ，７２　ｑＣ　５　ｍｉｎ，３０个循环：取５　ｔｘｌ　ＰＣＲ反　应液进行１％琼脂糖凝胶电泳检测：参照Ｇｅｌ／ＰＣＲ　ＤＮＡ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ胶回收试剂盒说明书切胶回收（紫　外灯下操作）得到线性ｐＭＤ１８．Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ．ＴＮＦＲ２１９６￣Ｇ　ＤＮＡ。③进行连接反应：Ｂｌｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｎａｔｉｏｎ反应液为：　线性ｐＭＤ１８一Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ—ＴＮＦＲ２　黼ＤＮＡ　１０　ｌ，１０×　Ｂｌｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｎａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ　２　Ｉｘｌ，Ｂｌｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｎａｔｉｏｎ　Ｅｎ—　ｚｙｍｅ　Ｍｉｘ　１　ｔｘｌ，ｄｄＨ２Ｏ　２０　ｔｚｌ，３７　ｃＩＣ反应１０　ｍｉｎ，７０　ｃｃ　１０　ｍｉｎ。Ｌｉｇａｔｉｏｎ反应：取约５　１的上述反应液，　加入５　ｌ的Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｉ，ｌ６℃反应１　ｈ，将反　应液用热休克法全量转化至Ｅｃｏｌｉ感受态细胞中　离心３０００　ｒ／ｍｉｎｘ５　ｍｉｎ，移走部分上清，余液混匀　后，吸取１００　ｌ已转化产物涂于ＬＢ平板（含１００　ｐ￣ｇ／ｍｌ氨苄青霉素钠），待液体吸收后，倒置平板，３７　℃温箱培养１２—１６　ｈ，观察菌落生长情况。＠ｐＭＤ１８一　Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ．ＴＮＦＲ２　重组体的鉴定：挑取ＬＢ平板上　的单克隆菌斑，摇菌后取３．５　ｍｌ菌液用ＴＩＡＮｐｒｅｐ　质粒小提试剂盒小量提取质粒ＤＮＡ，常规１％琼脂　糖凝胶电泳检测。分别用ＴＮＦＲ２基因两端的Ｈｉｎｄ　Ⅲ和ＥｅｏＲ　Ｉ酶切位点进行酶切鉴定。反应体系：提　取的质粒１０　ｐ．１，Ｈｉｎｄ　ＩＵ（１０　Ｕ／ｔｘ１）１　Ｉｘｌ，ＥｃｏＲ　Ｉ（１０　Ｕ／　１）１　Ｉｘｌ，１０ｘＢｕｆｆｅｒ　Ｒ　４　ｌ，灭菌蒸馏水２０　ｌ，反　应物轻轻混匀，３７℃水浴４　ｈ。酶切后常规电泳检测　ＴＮＦＲ２片段和载体的大小。经酶切鉴定后的菌液送　上海生工生物工程有限公司测序鉴定。　１．２．３　ｐｃＤＮＡ６．０－ＴＮＦＲ２　舢和ｐｃＤＮＡ６．０．ＴＮ．　Ｍ：ＤＭ５０００　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１～４：扩增严物ＰＣＲ　一　ＦＲ２　％ＡＲＧ载体构建：ｐＭＤ　１　８－Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ—ＴＮＦＲ２　、　图１　ｐＭＤ　１　８－Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ—ＴＮＦＲ２　ｐＭＤ　１　８一Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ—ＴＮＦＲ２　ＡＲｃ和ｐｃＤＮＡ６．０质粒ＤＮＡ　扩增产物的琼脂糖凝胶电泳　各取ｌ０　ｌ，分别进行Ｈｉｎｄｎｌ和ＥｃｏＲ　Ｉ双酶切反　应，反应体系同前，３７℃水浴４　ｈ，常规电泳后切胶　回收ＴＮＦＲ２　唧、ＴＮＦＲ２　。与ｐｃＤＮＡ６．０片段，将　ＴＮＦＲ２　％唧、ＴＮＦＲ２　。分别与ｐｃＤＮＡ６．０片段按体　积比为１０：１的比例混合，Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ１６℃过夜：　鉴定和测序进一步验证。将提取的质粒ｐＭＤ１８一Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ．ＴＮＦＲ２　％　重组体进行酶切鉴定（图３）。表　明：重组质粒经Ｈｉｎｄｍ和ＥｃｏＲ　Ｉ酶切释出的目的　片段相对分子质量约在１　３９８　ｂｐ左右．与理论预计　相符。将菌液测序，测序结果与ＧｅｎｅＢａｎｋ上发表的　ＴＮＦＲ２基因序列进行ＢＬＡＳＴ比对分析，测序结果　连接反应结束后，将连接产物转化人Ｅ．ｃｏｌｉ感受态　细胞，涂ＬＢ平板后过夜培养。在每个平板上用接种　针挑取约２０个白色单菌落进行摇菌获得菌液。经　引物设计．上游引物：５＇－ＣＣＣＣＣＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＡＧ．　ＣＡＣＴ一３　．下游引物：５　．ＴＡＣＣＣＣＧＧＧＣＣＴＦＡＴＣＧ—　示序列正确。　５０００　ｂｐ　ＧＣＡ．３　。ＰＣＲ反应体系：菌液２．０　ｌ，上下游引物各　０．５　ｔｘｌ，２ｘＭｉｘ　８　ｌ，加ｄｄＨ２Ｏ至２Ｏ　ｐ．１；ＰＣＲ扩增条　件：９５℃预变性１０　ｍｉｎ，９５℃变性３０　Ｓ，５２℃退火　Ｍ：ＤＭＳ０００　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１－１１：ｐＭＤＩ８一Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ－ＴＮＦＲ２　质粒　图２　ｐＭＤ　１　８一Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ—ＴＮＦＲ２　３０　Ｓ。７２　ｃＣ延伸４０　Ｓ，共３０个循环，７２℃终末延伸７　ｍｉｎ，１６　ｏＣ保存ＰＣＲ产物。取５　ｌ进行１％琼脂糖凝　胶电泳分析。　１．２．４　ｐｃＤＮＡ６．０一ＴＮＦＲ２　姗和ｐｃＤＮＡ６．０一ＴＮ—　质粒的琼脂糖凝胶电泳　Ｍ　１　２　ＦＲ２　惭的双酶切和测序鉴定：提取的ｐｃＤＮＡ６．０．　ＴＮＦＲ２　唧、ｐｃＤＮＡ６．０．ＴＮＦＲ２　邶真核表达质粒，　以Ｈｉｎｄ１１和ＥｃｏＲ　Ｉ双酶切鉴定阳性克隆。双酶切　反应体系和反应条件同前。之后进行１％琼脂糖凝　胶电泳分析鉴定。阳性克隆送上海生工公司测序鉴　定。　２结　果　Ｍ：ＤＭ５０００　ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１，２：ｐＭＤ１８一Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ—ＴＮＦＲ２　萎一　阳性克隆　图３　ｐＭＤ１８一Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ—ＴＮＦＲ２　阳性克隆的酶切鉴定　２．３　重组ｐＭＤ　１　８一Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ—ＴＮＦＲ２　唧、ｐＭＤ　１　８．Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ—ＴＮＦＲ２　ｐｌｅ．ＴＮＦＲ２　、ｐｃＤＮＡ６．０载体酶切结果：将提取　２．１　ｐＭＤ１８一Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ．ＴＮＦＲ２　椭扩增结果：以　ｐＭＤ　１　８一Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ．ＴＮＦＲ２　％唧为模板设计突变上下游　的质粒ｐＭＤ１８．Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ．ＴＮＦＲ２　肿、ｐＭＤ１８．Ｔ　ｓｉｍ．　、ｐｃＤＮＡ６．０经Ｈｉｎｄ　ｍ和ＥｃｏＲ　Ｉ酶切　１３９８　ｂｐ、空质　得到ＴＮＦＲ２　％唧１３９８　ｂｐ、ＴＮＦＲ２　４）。　引物，通过定点突变ＰＣＲ扩增后将产物进行１％琼　脂糖凝胶电泳得到４０９０　ｂｐ左右目的片段，与预期　大小完全相符（图１），说明成功将ｐＭＤ１８一Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ．　ＴＮＦＲ２　％僦扩增出来。　粒ｐｃＤＮＡ６．０出现一个带。约５１００　ｂｐ片段（见图　２．４　重组ｐｃＤＮＡ６．０一ＴＮＦＲ２　、ｐｃＤＮＡ６．０一ＴＮ．　２．２　ｐＭＤ１８．Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ．ＴＮＦＲ２　重组体的鉴定结　果：将质粒转化至感受态细胞中，涂板挑取单克隆菌　落，摇菌后提取质粒进行凝胶电泳，电泳结果见图　２．在４０９０处左右可见质粒ＤＮＡ大小，可通过酶切　ＦＲ２－９６ＡＲＧ载体ＰＣＲ鉴定结果：将图４中的１、２经双　酶切释出的片段ＴＮＦＲ２　幡ｒ、３释出的片段ＴＮ．　ＦＲ２ｍ僦和４￣６释出的ｐｃＤＮＡ６．０切胶回收后用Ｔ４　连接酶进行连接反应，连接后转化人感受态细胞中，　中国药物与临床２０１２年６月第１２卷第　塑　塑！旦！　塑　！　塑！　Ｑ　：　！！：　！　：　５０ｏ０　３ｏｏＯ　２Ｏ０ｏ　１５００　ｌｏｏＯ　Ｍ：ＤＭ５０００　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１、２：ｐＭＤＩ８一Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ—ＴＮＦＲ２　阳性克隆　３：ｐＭＤＩ８　Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ—ＴＮＦＲ２　阳性克隆；４－６：ｐｃＤＮＡ６．０　图４重组质粒的双酶切结果　倒置培养挑取单菌落，摇菌后做ＰＣＲ初筛。利用　ＴＮＦＲ２引物用１　ｌ菌液进行ＰＣＲ扩增和分析，产　物行琼脂糖凝胶电泳观察，重组质粒出现了约２００　ｂｐ的条带，空质粒对照组和未连接上目的片ｌ段的阴　性子则没有相应条带（见图５）。　１０００　７５０　５００　２５０　ｌ００　Ｍ：ＤＭ５０００　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１、３、５、７－９：重组质粒阳性子ＰＣＲ扩增产物　２、４、６：阴性子；１０．１２：空质粒对照　图５重组体扩增产物的ＰＣＲ鉴定　２．５阳性重组子ｐｃＤＮＡ６．０　ＴＮＦＲ２　唧、ｐｃＤＮＡ６．０．　ＴＮＦＲ２　酶切鉴定结果：重组质粒经Ｈｉｎｄ　ｍ和　ＥｃｏＲ　Ｉ双酶切后，行琼脂糖凝胶电泳观察，重组质　粒切出了约５１００　ｂｐ和１３９８　ｂｐ的２个片段，分别　与载体ＰｃＤＮＡ６．０和ＴＮ．ＦＲ２片段大小吻合，初步提　示可能是ＴＮＦＲ２基因片段己经插入到ｐｅＤＮＡ６．０　中（见图６）。　Ｍ：ＤＭ５０００　ＤＮＡ　Ｍａｒ一ｋｅｒ；１．３：ｐｃＤＮＡ６．０・ＴＮＦＲ２　阳性克隆：　　２：未酶切和连接成功；４，５：ｐｃＤＮＡ６．０－ＴＮＦＲ２　阳性克隆　图６重组质粒ｐｃＤＮＡ６．０一ＴＮＦＲ２　ｐｃＤＮＡ６．０一ＴＮＦＲ２　的双酶切结果　２．６　重组质粒ｐｃＤＮＡ６．０．ＴＮＦＲ２　１　９６ＭＥＴ、ｐｃＤ．　ＮＡ６．０一ＴＮＦＲ２１９６ＡＲＧ菌液测序结果：取ＰＣＲ初筛　的和双酶切鉴定的阳性重组子的菌液进行测序．插　入片段的ｒｓ１０６１６２２位点的碱基排列顺序与目的片　段一致，说明ｐｃＤＮＡ６．０．ＴＮＦＲ２’９６ＭＥＦ、ｐｃＤＮＡ６．０一　ｒＦＮＦＲ２　ＲＧ重组质粒构建成功，可用于下一步实验。　３讨　论　ＴＮＦ的生物学效应是通过细胞表面的２种　ＴＮＦ受体引发。ＴＮＦ受体有两种：ＴＮＦＲ１和ＴＮＦＲ２．　均为Ｉ型跨膜蛋白。ＴＮＦＲ１在体内大多数细胞表面　广泛分布，相对分子质量为５５　ｋＤａ，与ＴＮＦ结合复　合体的解离常数Ｋｄ＝２００～５００　ｐｍｏｌ／Ｌ，半数解离时　间为１８０　ｍｉｎ。ＴＮＦＲ２的表达主要局限在免疫细胞，　相对分子质量为７５　ｋＤａ，Ｋｄ＝３０　７０　ｐｍｏｌ／Ｌ，半数解　离时间为１０　ｍｉｎ。ＴＮＦＲ１和ＴＮＦＲ２的胞外区都含　有４个富含半胱氨酸的结构域（ｃｙｓｔｅｉｎｅ．ｒｉｃｈ．ｄｏ—　ｍａｉｎ，ＣＲＤ），每个ＣＲＤ包含６个半胱氨酸的高保守　氨基酸序列［　。ＣＲＤ独特的折叠方式决定了ＴＮＦ与　受体之间的特异性结合，与ＴＮＦ结合部位是ＣＲＤ２　和ＣＲＤ３。虽然ＣＲＤ１和ＣＲＤ４不直接参与对ＴＮＦ　的识别与结合，而它们的缺失导致与ＴＮＦ的结合能　力显著下降。ＴＮＦＲ２的６７６位Ｔ突变为Ｇ，使得　ＣＲＤ４的１９６位氨基酸改变，由Ｍｅｔ１９６替换为Ａｒｇ．　可能会影响ＴＮＦ与ＴＮＦＲ相结合的能力。　大量的研究和综述资料总结出ＴＮＦＲ信号传导　通路主要包括ｃａｓｐａｓｅ家族介导的细胞凋亡、衔接　蛋白ＴＲＡＦ介导的转录因子ＮＦ．ＫＢ和ＪＮＫ蛋白激　酶的活化。信号传导通路之间及各通路内部含有各　种调节机制，使ＴＮＦ的各种生物学功能协调发挥出　：来。ＴＮＦ由保守胞内结合域如ＤＤ死亡结构域．通过　同型／异型受体相互作用蛋白调节胞内信号转导。　ＴＮＦＲ２虽不具有ＤＤ结构域．不能通过ＤＤ直接激　活细胞凋亡的机制，但有结合ＴＮＦ受体相关因子　（ＴＲＡＦ）的基序，ＴＮＦＲ２与ＴＲＡＦ结合形成复合体　激活ＮＦ．ＫＢ和ＪＮＫ激酶，诱导基因转录，促进细胞　存活，增殖和分化。Ｔｉｌｌ等［９］将ＴＮＦＲ２的Ｍｅｔ１９６替　换为Ａｒｇ，突变体ＴＮＦＲ２招募ＴＲＡＦ２的能力以及　诱导依赖ＮＦ—ＫＢ的基因如ｃｌＡＰ表达大幅减少．引　起不同程度的慢性炎症机制紊乱。　定点突变是研究基因功能的重要技术之一。它　可以有目的改变ＤＮＡ序列中的碱基，不仅可以阐明　基因表达的调控机制，还可研究蛋白质结构与功能　的关系，也可以改变目的蛋白的氨基酸，使之符合研　究者的要求＿ｌ０］。最常用的是用ＰＣＲ技术进行定点突　变，其原理是利用导人变异点的引物进行ＰＣＲ反　应，对ＰＣＲ产物进行末端平滑化及５　磷酸化处理，　再用高效连接试剂Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｉ进行自身连接　（环化反应），然后转化、提取突变体ＤＮＡ。这种方法　・　７１６　・　主国堑塑量！　至　旦笙　鲞笙鱼塑　ｄｉｅｓ＆Ｃｌｉｎｉｃｓ，Ｊｕｎｅ　２０１２，Ｖ０１．１２，Ｎ。．６　ｓｅ　ｅ成功率高，操作简单，经济，是一种进行定点突变的　有效的方法［“］。　前期实验我们已经发现ＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲＳＦｌ　Ｂ）基　因翻译区１９６位２种单倍型（Ｔ、Ｇ）与冠心病的发病　相关，为了进一步研究不同单倍型对ＴＮＦＲ２基因表　达及功能的影响，我们通过定点突变的方法扩增了　ＴＮＦＲ２基因＋９０至＋１４７５基因全长，并对６７６位点　（ＭＡＰＫ）ｏｒ　ｐ３８　ＭＡＰＫ　ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ，２００１，３５９（Ｐｔ３）：　５２５．５３５．　Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ・Ｖｅｌｅｄｏ　Ｓ，Ｖｉｌａ．Ｂｅｄｍａｒ　Ｒ，Ｎｉｅｔｏ—Ｖａｚｑｕｅｚ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ｃ—　Ｊｕｎ　Ｎ—Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｋｉｎａｓｅ　１／２　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ－ａｌ—　ｐｈａ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｉｎｓｕｌｉｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｖｉｓｃｅｒａｌ　ｂｕｔ　ｎｏｔ　ｓｕｂｃｕ．　ｔａｎｅｏｕｓ　ａｄｉｐｏｅｙｔｅｓ：ｒｅｖｅｒｓａｌ　ｂｙ　ｌｉｖｅｒ　Ｘ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｇｏｎｉｓｔｓ．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　Ｍｅｔａｂ，２００９，９４（９）：３５８３．３５９３．　Ｓｃｈｕｌｚ　Ｒ，Ｈｅｕｓｃｈ　Ｇ．Ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ－ａｌｐｈａ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｒｅｃｅｐ—　ｔｏｒｓ　１　ａｎｄ　２：Ｙｉｎ　ａｎｄ　Ｙａｎｇ　ｉｎ　ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａ—　进行了定点突变，构建了含有２种不同单倍型的　ｐｃＤＮＡ６．０重组质粒。这两种单倍型重组质粒除了突　ｔｉｏｎ，２００９，１１９（１０）：１３８６—１３９７．　Ｐｏｐａ　Ｃ，Ｎｅｔｅａ　ＭＧ，ｖａｎ　Ｒｉｅｌ　ＰＬ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｒｄｅ　ｏｆ　ＴＮＦ－ａｌｐｈａ　ｉｎ　变的位点外。其余序列完全一致，因此，实验结果能　够反映这个ＳＮＰ位点对基因功能的影响。本实验设　计合成特异的引物，为方便克隆，在基因５　端、３　端　分别引人限制性内切酶Ｈｉｎｄｍ和ＥｃｏＲ　Ｉ的特异性　识别位点。我们利用ｐｃＤＮＡ６．０质粒上的多克隆位　点。将扩增的ＴＮＦＲ２基因片段插人ｐｃＤＮＡ６．０线性　质粒中，构建出ｐｃＤＮＡ６．０一ＴＮＦＲ２真核细胞表达质　粒。通过酶切及测序证实重组ｐｃＤＮＡ６．０．ＴＮ。　ＦＲ２　、ｐｃＤＮＡ６．０一ＴＮＦＲ２　％僦构建成功。而ｐｃＤ　ＮＡ６／ｍｙｃ．ｈｉｓＢ是一个同时带有稻瘟菌ｍｙｃ标签的　真核表达载体，在基因的功能研究中研究人员广泛　使用［１２１。可以利用其所携带的菌素抗性基因构建过　表达的稳定细胞株，为进一步研究ＴＮＦＲ２在心血管　疾病治疗中的作用提供了良好的实验基础。　参考文献　Ｒａｕｅｒｔ　Ｈ，Ｓｔｕｈｍｅｒ　Ｔ，Ｂａｒｇｏｕ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．ＴＮＦＲ１　ａｎｄ　ＴＮＦＲ２　ｒｅｇｕ—　ｌａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎ　ｍｙｅｌｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　Ｄｉｓ，２０ｌ　ｌ，２：１９４．　［２］　Ｊｕｐｐ　ＯＪ．ＭｃＦａｒｌａｎｅ　ＳＭ，Ａｄｅｒｓｏｎ　ＨＭ，ｅｔ　ａ１．ＴｙｐｅⅡｔｕｍｏｕｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ－ａｌｐｈａ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＮＦＲ２）ａｃｔｉｖａｔｅｓ　ｃ．Ｊｕｎ　Ｎ－ｔｅｒｍｉ—　ｎａｌ　ｋｉｎａｓｅ（ＪＮＫ）　ｂｕｔ　ｎｏｔ　ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｒｙ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ａｎｄ　ｃａｒｄｉｏｖａｓ　ｃｕｌａｒ　ｒｉｓｋ．Ｊ　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ，２００７，４８（４）：７５１—７６２．　Ｒｉｚｖｉ　ＡＡ．　Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ　ｍａｒｋｅｒｓ　ａｓ　ｍｅｄｉａｔｏｒｓ　ｏｆ　ｖａｓｃｕｌｏ—ｅｎ—　ｄｏｔｈｅｉａｌ　ｄｙｓｆｕｎｃｗｏｎ　ａｎｄ　ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｓｙｎ—　ｄｒｏｍｅ．Ｃｈｉｎ　Ｍｅｄ　Ｊ，２００７，１２０（２１）：１９１８－１９２４．　任俊峰，李俊男，苏锐，等．ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ基因多态性与冠心病的　相关分析．中国动脉硬化杂志，２０１１，１１（２）：１２８．１３１．　丘创华，侯敢，黄迪南．ＴＮＦ．“信号传导通路的分子机理．中国　生物化学与分子生物学报，２００７，２３（６）：４３０—４３５．　Ｔｉｌｌ　Ａ，Ｒｏｓｅｎｓｔｉｅｌ　Ｐ，Ｋｒｉｐｐｎｅｒ－Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｅｈ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　Ｍｅｔ一　１９６　Ａ唱ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｔ三１　ｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　２　（ＴＮＦＲ２）ａｆｆｅｃｔｓ　ＴＮＦ－ａｌｐｈａ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｂｙ　ｉｍｐａｉｒｅｄ　ＮＦ—　ｋＢ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ａｎｄ　ｔａｒｇｅｔ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２００５，２８０　（７）：５９９４—６００４．　Ｇｅ　Ｌ．Ｒｕｄｏｌｐｈ　Ｐ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｍｕｔａ—　ｔｉｏｎｓ　ｕｓｉｎｇ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ＰＣＲ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７，２２（１）：　２８—３０．　周赞虑，张永祥，陈枝华，等．基因改选中快速ＰＣＲ定点突变方　法应用．中国公共卫生，２００７，２３（１）：１０２—１０３．　王智新．荧光原位杂交技术在基因定位中的应用．生命科学仪　器，２００９，７（１２）：７－９．　（收稿日期：２０１２－０２—１５）