大鲵肉酶解产物的制备及其抗氧化性的研究

《河北渔业｝２０１２年第９期（总第２２５期）　ｏ研究与探讨　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４—６７５５．２０１２．０９．Ｏ０１　大鲵肉酶解产物的制备及其抗氧化性的研究　王文莉，张　伟，于新莹，李　伟，佟长青，曲　敏，金　桥　（辽宁省水产品加工及综合利用重点开放实验室，大连海洋大学食品工程学院，辽宁大连，１１６０２３）　摘　要：以大鲵肉为原料，利用Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｐ．酸性蛋白酶进行酶解，研究其最佳的酶解条件以及酶解产物的　抗氧化怍用。结果表明，大鲵肉酶解的最佳工艺条件为Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｐ．酸性蛋白酶加酶量为０．４　（质量比）　及底物浓度为０．１　ｇ／ｍＬ时，酶解时闻５．５　ｈ，ｐＨ　２．０，温度４５℃。时间飞行质谱表明酶解产物的分子量小于　２　０００，苯酚硫酸法测定糖含量为２　，Ｆｏ１ｉｎ一酚试剂法测蛋白含量为９３　。大鲵酶解产物清除羟基自由基　（・ＯＨ）和ＤＰＰＨ自由基的能力随浓度升高而增强。　关键词：大鲵肉；酸性蛋白酶；抗氧化活性　大鲵是世界上现存最大的也是最珍贵的两栖　动物ｎ　。它的叫声很像幼儿哭声，因此人们又叫　白含量采用Ｆｏｌｉｎ一酚法测定；采用三氯乙酸　（ＴＣＡ）沉淀大分子蛋白后，采用Ｆｏｌｉｎ一酚法测　定酶解液的肽含量。　１．２．３糖含量的测定　采用三氯乙酸（ＴＣＡ）沉　淀大分子蛋白后，用苯酚一硫酸法测定样品中糖　含量。　它“娃娃鱼”，是国家二类保护水生野生动物，是农　业产业化和特色农业重点开发品种。由于大鲵具　有较高的营养和药用价值，被视为珍品。大鲵肉　中蛋白含量丰富，氨基酸组成全面，符合人体需要　量模式，且呈味氨基酸含量和比例都较高，味道　鲜美［　。　１．２．４　大鲵肉酶解产物分子量的测定　大鲵肉　酶解液冻于后的产物用５～１Ｏ　Ｌ　０．１５　三氟乙　酸（ＴＦＡ）溶解后离心，取离心后的上清液与等体　积的基质混合点靶进行时问飞行质谱（ＭＡＬＤＩ—　ＴＯＦ）测定。质谱测定的条件：Ｎ　激光源，波长　３３７　ｎｍ，正离子线性方式检测（飞行管长１．６　ｍ，　加速电压为２５　ｋＶ）。基质：芥子酸（ＳＡ），用　０．１　ＴＦＡ／５Ｏ　的乙腈配成饱和溶液，再将该溶　液与０．１　混合。　１．２．５　清除羟基自由基（・ＯＨ）能力的测定　分别取酶解液２　ｍＬ，加人１　ｍＬ　９　ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｆｅ—　ＳＯ　，９　ｍｍｏｌ／Ｉ　的水杨酸一乙醇２　ｍＬ，混匀后加　ＴＦＡ／５０　的乙腈以１：１的比例　本文以大鲵肉为原料，利用酸性蛋白酶进行　酶解，对其酶解产物进行抗氧化活性试验，发现其　具有较强的抗氧化作用。　１材料与方法　１．１　材料　大鲵肉，２０１０年１０月由张家界（中国）金驰　大鲵生物科技有限公司提供。　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｐ．酸性蛋白酶由大连海洋大学　・张家界（中国）金驰大鲵生物科技有限公司生物　技术联合实验室制备。其它试剂均为国产分析纯　试剂。　１．２　方法　入质量分数为７．５　的双氧水２　ｍＬ启动反应，在　３７℃水浴保温３０　ｍｉｎ，以蒸馏水作为空对照，于　取新鲜的大鲵肉，　１．２．１　大鲵肉酶解液的制备５１０　ｎｍ下测吸光度，考虑到样品本身的吸光度以　９　ｍｍｏｌ／Ｉ　的ＦｅＳＯ４　１　ｍＬ，９　ｍｍｏｌ／Ｌ的水杨酸　洗净后用组织捣碎机研磨成糜状物，加入一定量　的水，搅拌均匀后加入酸性蛋白酶，改变酶解温　度、ｐＨ、加酶量和酶解时问等闲素，测定酶解产物　的肽得率口］。　１．２．２蛋白质含量和酶解液肽含量的测定　蛋　乙醇２　ｍＩ　，不同浓度的酶解液２　ｍＩ　为本底吸　收‘　・。清除率计算公式如下：　ＯＨ清除率／％一　一（Ａ＾一Ａ　）／　×１００　式中，Ａ。为空白对照的吸光度值；Ａ　为加入　１——　《河ｊ匕渔业））２０１２年第９期（总第２２５期）　样液的吸光度值；Ａ如为不加Ｈ　０。的样液的吸光　度值。　ｏ研究与探讨　升幅度趋于平缓，故确定酶解时间为５　ｈ最佳。　９０　８０　１．２．６　清除ＤＰＰＨ自由基能力的测定　用无水　乙醇配制２．０×１０　ｒａｏｌ／Ｌ的ＤＰＰＨ溶液，于棕　堡７ｏ　嚣６０　餐５Ｏ　４０　３０　色瓶中低温避光保存备用。分别取２　ｍＬ酶解液　于试管中，加入２　ｍＬ所配制的ＤＰＰＨ溶液，混合　均匀，在２５℃水浴中反应３０　ｍｉｎ，移人ｌ　ｃｍ比色　孵解时同Ｉｈ　管中，于５１７　ｎｍ处测定其吸光度值Ａｉ，同时测定　２　ｍＬ样液加２　ｍＬ无水乙醇２５℃水浴中反应３Ｏ　图２不同酶解时间对大鲵肉酶解的影响　２．１．３　ｐＨ值对大鲵肉酶解的影响　将酶解条　ａｒｉｎ后的吸光度值Ａｊ，以及２　ｍＬ　ＤＰＰＨ加２　ｍＬ　蒸馏水２５℃水浴中反应３０　ｍｉｎ后的吸光度值　Ａ。，酶解液对ＤＰＰＨ的清除率按下式计算：　清除率／　一Ａｏ一（Ａ；一Ａ　）／Ａ。×１００　式中，　为试剂空白的吸光值；Ａ　为样液的　吸光值；Ａｊ为样液本底的吸光值［６　］。　２结果与讨论　２．１　酶解大鲵肉制备低聚肽单因素条件的影响　２．１．１酶解温度对大鲵肉酶解的影响　将酶解　条件设定为：ｐＨ值２．０，加酶量为０．５　（质量　比），于４Ｏ、４５、５０、５５、６０℃下分别酶解４．５　ｈ，底　物浓度为０．１　ｇ／ｍＬ，测肽得率如图１所示。由图　１可知，当酶解温度在４０～６Ｏ℃之间变化时，随　着酶解温度继续上升，肽得率逐渐升高，当温度达　到５５℃，肽得率达到最大值后，再继续提高酶解　温度，所得的肽得率出现下降的趋势。温度过高，　可以使酶变性甚至失活。但当温度达到４５℃后，　肽得率变化不是很大，考虑到成本等问题，所以，　确定大鲵肉酶解反应的最适温度为４５℃。　图１　不同醺解温度对大鲵肉酶解的影响　２．１．２　酶解时间对大鲵肉酶解的影响　将酶解　条件设定为：ｐＨ值２．０，加酶量为０．５　（质量　比），于４５℃下分别酶解１．５、３、４、５、６　ｈ，底物浓　度为０．１　ｇ／ｍＬ。测定肽得率如图２所示。由图　２可知，当酶解时间在３～５　ｈ之间变化时，随着　酶解时间的增大肽得率不断增加，但在５　ｈ后上　一２一　件设定为：ｐＨ分别为２．０、２．５、３．０、３．５、４．０，加　酶量为０．５　（质量比），于４５℃下酶解５　ｈ，底物　浓度为０．１　ｇ／ｍＬ。测定肽得率如图３所示。由　图３可知，随着ｐＨ的不断升高，肽得率出现下降　趋势，所以，大鲵肉酶解液反应的最适ｐＨ为　２．０　８４　８２　８０　母７８　潞７６　啦７４　餐７２　７０　６８　６６　２　２．５　３　３．５　４　ｐＨ值　圈３不同ｐＨ值对大鲵肉酶解的影响　２．１．４酶加量对大鲵肉酶解的影响　将酶解条　件设定为：ｐＨ值２．０，加酶量为０．２　９，６、０．３　９，６、　０．４　、０．５　、０．６　（质量比），于４５℃下分别酶解　５　ｈ，底物浓度为０．１　ｇ／ｍＬ。测定肽得率如图４　所示。由图４可知，当加酶量不断增加时，肽得率　不断上升，当酶加量大于０．３　时，肽得率上升幅　度平稳，综合成本和肽得率两方面考虑，确定酶加　量为０．４　（质量比）。　９０　８５　堡８０　妻７５　餐７０　６５　６０　图４不同加酶量对大鲵肉酶解的影响　２．１．５　最佳酶解条件的确定　影响酶解反应的　几个主要因素为酸性蛋白酶的加酶量、酶解时间、　ｐＨ和酶解温度。根据上述单因素试验分析，并　考虑生产成本等因素，以所得肽得率为指标做酶　《河北渔业））２０１２年第９期（总第２２５期）　加量，酶解时间，ｐＨ和温度４因素３水平的正交　试验Ｌ９（３４），正交试验的因素水平见表１，正交　ｏ研究与探讨　以最优水平为Ｂ。Ｃ。Ｄ２Ａ　，即ｐＨ为２．０，酶解温度　为４５℃，酶解是间为５．５　ｈ。加酶量为０．４　（质　试验结果见表２。　表１　正交因素水平表　注：Ａ：ｐＨ；Ｂ：酶解温度（℃）；Ｃ：酶解时间（ｈ）；Ｄ：加酶量　（质量比）　表２正交试验安排及结果　ｌ　１　１　１　１　８４．４３　２　ｌ　２　２　２　７６．７９　３　１　３　３　３　７９．１６　４　２　１　２　３　７７．５１　５　２　２　３　ｌ　７８．６６　６　２　３　１　２　７３．８９　７　３　ｌ　３　２　９２．１２　８　３　２　１　３　７２．８４　９　３　３　２　１　６４．４３　Ｋ１　２４０．５５　２５４．１　２３１．１６　２２７．５２　Ｋ２　２３０．１　２２８．４６　２１８．９４　２４２．９７　Ｋ３　２２９．３９　２１７．４８　２４９．９４　２２９．５５　ｋｌ　８０．１８　８４．７　７７．０５　７５．８４　ｋ２　７６．７　７６．１５　７２．９８　８Ｏ．９９　ｋ３　７６．４６　７２．４９　８３．３１　７６．５２　Ｒ　３．７２　１２．２ｌ　１０．３３　５．１５　注：Ａ：ｐＨ；Ｂ：酶解温度（℃）；Ｃ：酶解时Ｉ司（ｈ）；Ｄ：加　酶量（质量比）　由表２可知，各因素对酶解大鲵肉制备低聚　糖肽影响的大小顺序为Ｂ＞Ｃ＞Ｄ＞Ａ，即酶解温　度＞酶解时问＞加酶量＞ｐＨ。各个因素的影响　顷序为Ｂ　Ｃ。Ｄ。Ａ　，由表２可以看出，Ｂ　Ｃ　Ｄ　Ａ。　肽得率最高，因为ｐＨ值的影响不是最明显的，所　量比）。　２．２大鲵肉酶解产物分子量的测定　圈５大鲵酶解液飞行质谱图　图５的飞行质谱表明酸性蛋白酶酶解大鲵肉　获得的产物，确定为低聚肽，核质比在小于２　０００　的区域。ｍ／ｚ主要有９４８．３６５、１　０２０．１０５、　１　１５０．２１９、１　２６２．８６４、１　４３５．４１１、１　８３０．８３５。∞　舳　∞如柏∞加ｍ　０　　２．３大鲵肉酶解液抗氧化性的研究　２．３．１　清除羟基自由基（・ＯＨ）能力测定　准　确称取冻干后的酶解产物，将其配成２　ｍｇ／ｍＬ的　溶液，分别取０．６　ｍＬ、１．０　ｍＬ、１．４　ｍＬ、１．８　ｍＬ、　２．０　ｍＬ上述溶液，按１．２．５的方法测定其清除羟　基自由基能力，结果如图６。　瓣　篮　艇　瑚　也　皿　蝴　搬　图６渭除羟基自由基（・ＯＨ）能力测定　随着酶解液浓度的增加，羟基自由基　（・ＯＨ）的清除率达到８６　左右就趋于平缓增加　状态，一直增加到８９　左右，清除率不再增大，故　大鲵酶解液肽粉的浓度达到２　ｍｇ／ｍＬ，清除羟基　自由基（・ＯＨ）能力达到最大。　２．３．２　清除ＤＰＰＨ自由基能力的测定　准确称　取冻干后的酶解产物，将其配成２　ｍｇ／ｍＬ，分别　取０．６　ｍＬ、０．８　ｍＬ、１．０　１ＴＩＬ、１．２　ｍＬ、１．４　ｍＩ　上　述溶液，加蒸馏水至２　ｍＬ，按１．２．６的方法测定　一３一　《河北渔业》２０１２年第９期（总第２２５期）　其清除ＤＰＰＨ自由基能力，结果如图７。　ｏ研究与探讨　浓度达到１．２　ｍｇ／ｍＬ时，ＤＰＰＨ清除率达到　最大。　薅　蜒　∞　∞如∞∞加ｍ　Ｏ　参考文献：　［１］高士贤，戴定远，范勤德．常见药用动物［Ｍ］．上海：上海科技　｝Ｈ版社，１９８４　至　叁　［２］马小燕，陈易彬，李彦军．酶法水解大鲵蛋白的Ｔ艺研究［Ｊ］．　中国酿造，２００９，２１２（１１）：９２—９４　Ｏ．６　０．８　１　１．２　１．４　［３］刘程惠，董秀萍，赵露露．等．胰蛋白酶酶解法制备海参肽的下　酶解液浓度　ｇ．ｍＬ‘’　艺条件［Ｊ］．大连轻Ｔ业学报，２００６，２５（１）：８３—８５　图７　清除ＤＰＰＨ自由基能力的测定　［４］马利华，贺菊萍，秦卫东，等．槐花提取物抗氧化性能研究　随着酶解产物浓度的增加，ＤＰＰＨ的活性清　［Ｊ］．食品科学，２００７，２８（９）：７５—７７　［５３白鹤，赵前程，李伟，等．酶水解美洲帘蛤蛋白质及其产物抗　除率达到８０％左右就趋于平缓状态，故大鲵酶解　氧化活性初探［刀．水产科学，２００９，２８（４）：１９６—１９９　液肽粉的浓度达到１．２　ｍｇ／ｍＬ，ＤＰＰＨ清除率达　［６］Ｘｉｅ，Ｚ．，Ｈｕａｎｇ　Ｊ．，Ｘｕ，Ｘ．，＆Ｊｉｎ，Ｚ．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　到最大。　ｏｆ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ａｌｆａｌｆａ　ｌｅａｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ．　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００８，１１１，３７０—３７６　３结论　［７］Ｓｉｎｇｈ，Ｎ．，＆Ｐ．Ｓ．，Ｒ．．Ｆｒｅｅ　ｒａｄｉｃａｌ　ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ａｌｌ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　ｐｏｔａｔｏ　ｐｅｅ１．Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００４，　由试验结果可知，酸性蛋白酶水解大鲵肉的　８５：６１１—６１６　最适条件为ｐＨ为２．０，酶解温度４５℃，酶解是问　［８］Ｓｏｎｇ，Ｌ．，Ｌｉ，Ｔ．，Ｙｕ，Ｒ．，Ｙａｈ，ｃ．，Ｒｅｎ，Ｓ．，＆Ｚｈａｏ，　５．５　ｈ，加酶量０．４％（质量比）。酶解产物具有清　Ｙ．．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｒｃａ　ｓｕｂｃｒｅｎａｔａ　除羟基自由基和ＤＰＰＨ自由基的能力，测定结果　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｒｅｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．Ｍａｒｉｎｅ　Ｄｒｕｇｓ，２００８，６：６０７　表明当大鲵肉酶解液低聚肽的浓度达到２　ｍｇ／　６］９．　ｍＬ，清除羟基自由基（・ＯＨ）能力达到最大，当　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ　ｏｆ　ｆｌｅｓｈ　ｆｒｏｍ　Ａｎｄｒｉａｓ　ｄａｖｉｄｉａｎｕｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ＷＡＮＧ　Ｗｅｎ—ｌｉ，ＺＨＡＮＧ　Ｗｅｉ，ＹＵ　Ｘｉｎ—ｙｉｎｇ，ＬＩ　Ｗｅｉ，　Ｔ０ＮＧ　Ｃｈａｎｇ—ｑｉｎｇ，ＱＵ　Ｍｉｎ，ＪＩＮ　Ｑｉａｏ　（Ｋｅｙ　ａｎｄ　Ｏｐｅｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ａｑｕａｔｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ａｎｄ　Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉａｏｎｉｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ。　Ｄａｌｉａｎ　Ｏｃｅａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌｉａｏｎｉｎｇ　Ｄａｌｉａｎ　１１６０２３）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｌｅｓｈ　ｏｆ　Ａｎｄｒｉａｓ　ｄａ　ｖｉｄｉａｎｕｓ　ｗａｓ　ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ａｃｉｄ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ａｒｔｉｃｌｅ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｆｌｅｓｈ　ｏｆ　Ａｎｄｒｉａｓ　ｄａｖｉｄｉａｎｕｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｌｙｚａｔｅ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｏｐｔｉｍａＩ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｌｅｓｈ　ｏｆ　Ａｎｄｒｉａｓ　ｄａｖｉｄｉａｎｕｓ　ｗｅｒｅ　０．４％　（ｍａｓｓ　ｒａｔｉｏ）ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ａｃｉｄ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ａｎｄ　０．１　ｇ／ｍＬ　ｏｆ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ。ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｗａｓ　５．５　ｈ，ｐＨ２．０，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｗａｓ　４５℃．Ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ＭＡＬＤＩ—　ＴＯＦ　ｔｏ　ｂｅ　ｌｅｓｓ　ｔｈａｎ　２　０００．ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｗａｓ　２　ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｐｈｅｎｏｌ－－　ｓｕｌｆｕｒｉｃ　ａｃｉｄ　ｍｅｔｈｏｄ。Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　Ｌｏｗｒｙ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｉＳ　９３　．Ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｗｅｌｌ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ　ｈｙ—　ｄｒｏｘｙｌ　ｆｒｅｅ　ｒａｄｉｃａｌ　ａｎｄ　ＤＰＰＨ　ｆｒｅｅ　ｒａｄｉｃａｌ　ａｐｐｅａｒｅｄ　ｌｉｎｅａｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｆｌｅｓｈ　ｏｆ　Ａｎｄｒｉａｓ　ｄａｖｉｄｉａｎｕｓ；Ａｃｉｄ　ｐｒｏｔｅａｓｅ；Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　（收稿日期：２０ｌ２—０５—３１）