外源NGF促进大鼠皮肤创面模型损伤修复的机制研究

外源NGF促进大鼠皮肤创面模型损伤修复的机制研究

摘要 目的：探究外源NGF对大鼠创面的治疗作用及机制。方法：在SD雄性大鼠的背部脊柱的两侧手术切开形成两个2 cm x 2 cm的伤口，右边伤口处给予20 mg/ml NGF 1 ml，左边伤口给等量生理盐水作为对照组。隔天给药到第14天（第14天停止给药），分别于d3、d7、d14统计创面伤口愈合率，并取这3个时间点的组织用免疫组化的方法检测转化生长因子 （ transforming growth factor-β1，TGF-β1）、CD68-阳性巨噬细胞、增殖性细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF-1）的表达量。结果：NGF组的创面愈合率明显高于生理盐水组，并且NGF组TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1的蛋白表达量也显著高于生理盐水组（P＜0.05）。结论：外源NGF具有促进创面愈合作用，其机制可能与趋化炎症因子、加快血管生成、促进PCNA、TGF-β1的表达相关。

ABSTRACT Objective： To study the therapeutic effect of nerve growth factor （NGF） on wound healing in rats and its mechanism. Methods： Two full thickness wounds （2 cm x 2 cm） extending through the panniculus carnosus were made on both sides of the back spine in SD male rats. The right incision （designated as an experimental group） was treated with 1 ml of NGF （20 mg/ml， dissolved in 0.9% sterile saline） every other day till 14th days while the left incision （designated as a control group） with equal amounts of 0.9% sterile saline. The rates of wound healing were recorded at day 3， 7 and 14 and the expression of transforming growth factor-β1 （TGF-β1）， CD68+ macrophages， proliferating cell nuclear antigen （PCNA） and vascular endothelial growth factor （VEGF-1） in wound tissues sampled at day 3，7 and 14 were detected by immunohistochemistry staining. Results： The rates of wound healing and the protein expression of TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1 were obviously higher in the experimental group than in the control group （P＜0.05）. Conclusion： The mechanism of NGF in the promotion of wound healing might be related to the chemotactic factor， the promotion of angiogenesis and the expression of PCNA and TGF-β1.

KEY WORDS nerve growth factor； wounds healing； chemotactic factors； vasculogenesis； cell proliferation

神经生长因子（NGF）最早于1953年被Levi-Montalcini发现，并因此获得了1986年诺贝尔医学生理学奖。目前多用的是鼠源性NGF，包含a、b、g 3个亚单位，活性区是b亚单位，由两个118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成的二聚体[1] 。研究发现NGF具有：①促进神经元分化再生[2] ；②维持神经元的存活、生长、发育，尤其是对多巴胺能神经元的保护作用；③促进神经元的修复[3] ；④促进创口的表皮细胞、真皮细胞的生长，使其修复愈合[4] 。

皮肤创伤是一个复杂的病理过程，包括炎症反应、细胞增殖、创面收缩、胶原代谢、新生血管形成及增殖、感觉末梢神经的恢复等基本过程，临床表现为局

部炎症反应、细胞增殖分化及肉芽组织形成、组织重建三个阶段[5] 。大量研究证实：创面愈合的各阶段均有NGF参与并发挥重要作用。本研究将通过构建大鼠皮肤创伤实验模型，给予外源NGF治疗，在不同的时间点统计伤口愈合率，通过免疫组化染色对TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1的蛋白表达量进行检测分析，探讨NGF促进皮肤创伤修复的相关机制。材料与方法

材料

SPF级成年雄性SD大鼠30只，体重200～250 g，购自上海斯莱克实验动物中心（医动字第04-20-3号）。UltraSensitiveTM S-P 超敏试剂盒（福州迈新，产品编号：KIT-9710）。外源性NGF由厦门北大之路生物科技有限公司提供。

方法

动物模型的建立

用8%的水合氯醛对实验大鼠经腹腔注射进行麻醉，麻醉后固定于简易操作台，剪去背部毛发，用碘伏对背部皮肤进行消毒。用剪刀在其背部以脊柱为对称轴的两侧剪两个2 cm x 2 cm的伤口。右侧伤口给20 mg/ml NGF 1 ml，左侧给予等量的无菌生理盐水（0.9%氯化钠溶液）。隔天给药到第14天（第14天不给药）。

创面愈合率的统计

分别于d1、d3、d7和d14量取伤口未愈合面积（用透明的纸画下伤口面积，再将画下的面积复印到坐标纸上，数格计算出面积），计算比较伤口愈合率。伤口愈合率（%）=（开始时伤口面积-取材日伤口面积）/开始时伤口面积×100%[6] 。

皮肤组织处理

1）于d3、d7各处死5只大鼠，d14处理全部大鼠，取其背上创面的全层皮肤，进行石蜡包埋处理，切片厚度为7 mm。

2）通过免疫组化将已经包埋好的组织切片进行染色检测，依次经过二甲苯及不同浓度梯度的酒精进行脱蜡后，在清水中冲洗一段时间，加入3% H2O2浸泡10 min，除去内源性的过氧化氢酶后再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中加热3 min（温度：95 ℃左右），使抗原的位点暴露出来，冷却至室温后进行血清封闭。再依次进行加一抗、二抗、SABC和由DAB/H2O2/磷酸缓冲液配置的染色液处理。随后加入苏木精中复染，脱水后进行封片，检测TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1的蛋白表达量，根据检测结果进一步对NGF是否有促进创面愈合作用作出判定[7-10] 。

结果

创面愈合率

NGF组与生理盐水组在d1、d3、d7、d14的皮肤愈合率见表1，其差异具有统计学意义（P＜0.05），表明外源NGF能够加速创面的愈合。

TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1的蛋白表达量

TGF-β1是一族多肽类生长因子，可以作用于成纤维细胞，促进细胞增殖分化，抑制细胞凋亡，合成胶原蛋白，并调节创伤中各细胞间的相互作用，加速创面的愈合[7]。TGF-β1抗原表达多少与细胞增殖成正相关，可以反映出细胞的增殖状态。由此推断NGF能促进细胞增殖，从而促进伤口愈合（图1）。

CD68是主要的单核-巨噬细胞抗原，其表达可以反应出巨噬细胞的分布，推测NGF可以诱导炎症细胞在创面的聚集（图1）。

PCNA阳性表达的强弱代表细胞增殖活动的高低，在细胞增殖的启动上起着重要作用，是目前能较好反映细胞增殖状况的指标[8]。表明NGF有利于伤口的愈合（图1）。

VEGF-1作为一种血管生成调节因子，在创伤早期的大量表达有助于伤口的愈合[9-10]。推断NGF可以促进VEGF-1表达，使创面处的血管细胞处于增殖状态，从而加快伤口的愈合（图1）。

讨论

创伤愈合是一个涉及分子、细胞和组织水平的复杂生物学过程。在创面组织损伤修复过程中，细胞因子几乎调控损伤后皮肤再生的全过程，包括细胞趋化、增殖、基质合成与降解、炎症反应等多方面。TGF-β1作为一种大分子复合体作用于成纤维细胞，促进细胞外基质产生并抑制其降解，对细胞增殖、分化起重要调节作用[11]。CD68在伤口炎症反应阶段主要是趋化、聚集炎症细胞，并清除坏死组织及细胞碎片[12] 。PCNA可促细胞增殖，并在细胞生长S期大量表达，故可将其作为评价细胞增殖状态的重要指标[13] 。VEGF-1可直接作用血管内皮细胞，加强血管通透功能，促进血管内皮细胞增殖而形成新血管[14-15] 。以上4种蛋白的作用均在创伤愈合过程中有重大意义。

NGF作为一种神经生长因子，与碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）都是多功能的生物活性多肽，目前在临床创面修复治疗中，bFGF冻干粉已经成为一种重要的生物治疗药物。有文献报道，在切断成年大鼠的坐骨神经后，坐骨神经断端吻合口处会立刻观察到内源性NGF大量表达[5，16] ，表明NGF也会参与细胞的再生修复及伤口愈合的过程。由此推测NGF在创面愈合方面具有与bFGF相似的生物学效应[17]。为进一步探究NGF对皮肤创伤愈合的修复机制，本研究通过外源给予创伤模型NGF，并于不同的时间点对创面的愈合情况进行统计分析，发现NGF组的愈合情况要明显好于生理盐水组，但需要考虑到的一点是，大鼠皮肤与人体皮肤存在着差异，相对而言大鼠对皮肤创面具有更强的修复作用，因此在表1中，NGF组与生理盐水组在d14都有较

好的愈合效果。但总体而言，给予NGF后能够显著提高创面修复能力。本文实验还分别对TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1的表达量进行检测，发现TGF-β1在d3、d7的表达量明显高于生理盐水组，愈合完全后（d14）表达量有所下降，原因可能是由于NGF组在d14已经达到几乎完全愈合的效果，因此TGF-β1的表达量有所下降，而生理盐水组在d14并未达到完全愈合效果，所以TGF-β1的表达量仍处于一个相对较高的水平。同样地，NGF组的CD68、PCNA、VEGF-1的表达量在d3、d7也显著高于生理盐水组，并在d14相对低于生理盐水组，这表明了NGF的给予会促进这4种蛋白的表达，从而达到加快伤口愈合的生物学效应。另外发现给予NGF后，PCNA在d3的表达要高于d7，推测其原因为大鼠皮肤出现创面时，其机体自身会即刻通过不同的细胞增殖来进行创面的修复，因而在d3其表达量较高。而NGF促进创面愈合的作用很有可能与促进胶原蛋白的沉积、血管的生成、加速伤口处的血液循环，使氧和营养物质能够到达伤口部位，让细胞得到充分的增殖，为伤口愈合提供有利的条件等有关，其具体机制仍有待于进一步的研究探明。由此可见，NGF在创面修复中潜在的应用价值正在渐渐的凸显出来。继续探究NGF对创面愈合的修复机制，更好地利用NGF自身的生物学特点，将是今后研究的一个重点和方向，也将为临床治疗难愈创面提供新的策略。

参考文献

Hayashi K， Storesund T， Schreurs O， et al. Nerve growth factor beta/pro-nerve growth factor and their receptors[J]. Eur J Oral Sci， 2007， 115（5）： 344-354.

林强， 蔡杨庭， 李皓莘. 负载浓度梯度NGF的周围神经导管修复大鼠周围神经缺损的实验研究[J]. 中国修复重建外科杂志， 2014， 28（2）： 167-172.

张晓， 王廷华， 彭阳， 等. 坐骨神经切断对大鼠脊髓背根节NGF和BDNF表达的影响[J]. 西南国防医药， 2003， 13（4）： 372-374.

Muangman P， Muffley LA， Anthony JP， et al. Nerve growth factor accelerates wound healing in diabetic mice[J]. Wound Repair Regen， 2004， 12（1）： 44-52.

杨敏烈， 黄金井. 神经生长因子的作用及其在创面修复和瘢痕形成中的意义[J]. 组织工程与重建外科， 2008， 4（1）： 56-58.

黄康， 陈玉林. 创面愈合评价指标进展[J]. 中国修复重建外科杂志， 2001， 15（2）： 126-128.

王振宜， 章云， 李斌. TGF-β在创面愈合及瘢痕形成中作用的研究进展[J]. 中国中西医结合外科杂志， 2004， 10（6）： 463-464.

汤梦倩， 刘学红. 增殖性细胞核抗原和小肠发育的关系[J]. 中国组织工程研

究， 2012， 16（18）： 3380-3382.

Semenza GL. Development of novel therapeutic strategies that target HIF-1[J]. Expert Opin Ther Targets， 2006， 10（2）： 267-280.

蔡源源， 李光早. 血管内皮生长因子的调控及其作用研究进展[J]. 组织工程与重建外科杂志， 2011， 7（1）： 51-54.

Roelen BA， Dijke PT. Controlling mesenchymal stem cell differentiation by TGFBeta family members[J]. J Orthop Sci. 2003， 8（5）： 740-748.

郭英军， 赵玉铭， 王雅坤， 等. 成人正常皮肤CD68阳性单核-巨噬细胞分布的研究[J]. 中华皮肤科杂志， 2005， 38（2）： 74-76.

王珂， 李荣贵， 程殿林. 增殖细胞核抗原（ PCNA） 功能及晶体结构研究进展[J]. 山东轻工业学院学报， 2013， 27（3）： 26-31.

张淑芝. 血管内皮生长因子研究进展[J]. 潍坊学院学报， 2012， 12（2）： 54-58.

Kikuno N， Kawamoto K， Hirata H， et al. Nerve growth factor combined with vascular endothelial growth factor enhances regeneration of bladder acellular matrix graft in spinal cord injury-induced neurogenic rat bladder[J]. BJU Int， 2008， 103（10）： 1424-1428.

于洋， 洪仕君， 赵丽萍， 等. 神经生长因子NGF 的神经元保护作用机制及临床应用研究现状[J]. 昆明医科大学学报， 2014， 35（2）： 148-151.

Yang Y， Xia T， Chen F， et al. Electrospun fibers with plasmid bFGF polyplex loadings promote skin wound healing in diabetic rats [J]. Mol Pharm， 2011， 9（1）： 48-58.

（收稿日期：2014-06-10）