①张建军 罗兆榴 (广东省人民医院检验科,广州510080)
中国图书分类号 R392111 文献标识码 A 文章编号 10002484X(2005)0720508205
[摘 要] 目的:探讨心脏移植慢性排斥反应的发病机制。方法:通过DSBT(DonorSpecificBloodTransfusion)诱导耐受,建
立同种异体大鼠心脏移植慢性排斥的模型。采用免疫组化和Northernblot方法检测大鼠心脏移植慢性排斥反应时浸润细胞的
++++
表型及分布,胞间黏附分子和生长因子的表达。结果:慢性排斥组的心肌CD45+、CD4、CD8、TCR、CD45RB细胞、巨噬细胞和NK细胞显著升高。这些细胞主要分布在心肌间质、血管周围和心内膜下区域,并以T淋巴细胞和巨噬细胞为主。在损伤区域可见Ⅰ型细胞间黏附分子(ICAM21)、Ⅰ型淋巴细胞功能性抗原(LFA21)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因
ββ子β1(TGF21)表达增强。TGF21mRNANorthernblot分析,慢性排斥组比正常对照组升高5～6倍。结论:T细胞和巨噬细胞在
β心脏移植慢性排斥的损伤中起主要作用,ICAM21、LFA21、bFGF和TGF21也参与了心脏移植物血管病(Cardiacallograftvasculopa2
phy,CAV)的形成。
[关键词] 心脏移植;慢性排斥;细胞免疫;胞间黏附分子;生长因子
Mechanismsofchronicinjuryinamodelofheartallograftchronicrejection
ZHANGJian2Jun,LUOZhao2Liu.DepartmentofClinicalLaboratory,GuangdongProvincialPeople’sHospital,Guang2zhou510080,China
[Abstract] Objective:Tostudythemechanismsofchronicinjuryinheartallograftwithchronicrejection.Methods:Amodelofcardiacchronicrejectionintheratbasedontoleranceinducedthroughdonorspecificbloodtransfusionswasused.Thesubpopulationandthedistribu2tionofinfiltratingcellsandtheexpressionofadhesionmoleculeandgrowthfactorswerestudiedbyimmunohistochemistryandNorthernblotanalysisinthechronicrejectionmodel.Results:InfiltratingcellswerepredominantlyTlymphocytesandmacrophages,mostlyevidentinthein2terstitial,subendocardialandperivascularareas.AllograftsweredemonstratedsignificantlyelevatednumberofCD45,CD4,CD8,TCR,+
CD45RBcells,macrophages(ED1)andNKcellsatboth3and6monthscomparedwithnormalratheartsandisograftsat3months.DamagedareasalsowereobservedexpressionoftheadhesionmoleculesICAM21,LFA21,basicfibroblastgrowthfactor(bFGF)andtransforminggrowth
ββfactor(TGF21).NorthernblotanalysisoftotalRNA,showed5to6foldupregulationofTGF21mRNAinthechronicrejectionmodelcompared
withnormalrathearts.Conclusion:TheseresultssuggestthatTlymphocytesandmacrophagesplayacentralroleinthedevelopmentonchronic
βrejectionandtheincreasedexpressionofICAM21,LFA21,bFGFandTGF21inthismodelsupportstheinvolvementoftheseadhesionmoleculesandgrowthfactorsinthedevelopmentofcardiacallograftvasculopaphy.
[Keywords] Hearttransplantation;Chronicrejection;Cellularimmunity;Adhesionmolecules;Growthfactors
+
+
+
+
慢性排斥是影响移植物长期存活的主要障碍,
心脏移植5年存活者中约有50%以上出现慢性排
1,2
斥损伤。慢性排斥的病因与发病机制复杂,至今仍未完全阐明。缺血、再灌注、外科损伤、感染、免疫抑制剂和体液免疫一直被认为是引起慢性排斥的主要因素,然而近年来许多学者提出细胞毒细胞、杀伤细胞及巨噬细胞等也可能参与其病理损害。这些细胞可能通过活化后产生和释放大量的细胞因子调节免疫反应,介导细胞损伤。本研究应用一同种异体大鼠心脏移植慢性排斥的模型,探讨细胞免疫、黏附分子和生长因子在心脏移植慢性排斥反应中的作用。
①广州市第一人民医院心胸外科,广州510180
作者简介:张建军(1953年-),女,副主任技师,主要从事免疫学和
流式细胞术临床研究,E2mail:zhangjianjun@MSN.com。
1 材料与方法
111 心脏移植手术方式 此研究基本按照Ono2Lindsey的方法进行心脏异位移植术式:实验动物
3
麻醉先以戊巴比妥钠(40mgΠkg)作腹腔内注射,然后用甲氧氟烷吸入维持。供体鼠先行升主动脉阻断,用4℃晶体冷停跳液作间接冠状动脉灌注,诱停心搏,立即剪出供心,冲洗后浸泡于上液中,分别结扎腔静脉和肺静脉,在距根部2～3mm处修剪主动脉和肺动脉残端。然后移至受体鼠腹腔内,应用显微外科技术将供心的升主动脉和肺动脉分别与受体的腹主动脉和下腔静脉作端2侧吻合。112 实验动物模型
11211 同种异体移植组(Allograft) Albino2Surgery(AS)(RT1l)品系成年雄性大白鼠作为受者,Dark2
张建军等 心脏移植慢性排斥反应机制的探讨 第7期Agouti(DA)(RT1avl
)品系成年雄性大黑鼠作为供者,
所有实验动物来自墨尔本Monash大学动物供应中心。AS鼠在移植前进行DSBT治疗4
:即在移植前第10天和第6天输入DA鼠外周血1ml,第12天至
第4天用环孢素A(CsA)治疗(5mgΠkg-1・d-1
)。DA鼠心脏异位植入经治疗AS鼠体内。移植后不再使用任何免疫抑制剂,3个月取6只,6个月取5只AS鼠处死,取出移植心。将心脏一分为二,一半用10%的福尔马林固定,另一半放入液氮中速冻后置-80℃保存。11212 同种同系移植组(Isograft) 9只成年雄性DA鼠作同系心脏异位移植,3个月后处死,取其心
脏作为非异基因损伤对照。
11213 正常对照组 取3只正常成年雄性DA大鼠心脏作为正常对照。实验中所有大鼠均给予标准饲料喂养。113 检测方法11311 病理学检查 将福尔马林固定的心肌组织,
石蜡包埋,分段切取3张切片,HE染色,光镜下观察心脏病理变化。
11312 免疫组织化学四层PAP法染色5
取-80℃保存的心脏组织冰冻切片,用4%多聚甲醛固定,第1层为小鼠抗大鼠单克隆抗体:Ox1(CD45)、W3Π25(CD4)、Ox8(CD8)、R73(TCR)、Ox22(CD45RB)、ED1(单核细胞和巨噬细胞)、Ox33(B淋
巴细胞)(墨尔本Monash大学医学院提供)α,2SMA(α2平滑肌肌动蛋白,Sigma),31213(NK细胞)、ICAM2
1、LFA21、TGF2β1(Serotec)和bFGF(UBI),第2层为羊
抗小鼠IgG(Dako),第3层为兔抗羊Ig(Dako),第4
层羊抗过氧化酶抗体(Dako)。11313 Northernblot分析 称取-80℃保存的心脏组织,用RNAzolB(BiotecxL)提取液提取组织中总
RNA,变性,1%琼脂糖电泳分离TGF2β1带,然后将
其印迹在尼龙膜(Hybond2N,Amersham)上,用TGF2β1
cDNA探针杂交和32
P2dCTP(Amersham)标记,将标记的尼龙膜在X线下曝光到胶片上。同时用720bp的甘油醛232磷酸脱氢酶(GAPDH)cDNA进行质量控
制,用TGF2β1阳性的移植肾作阳性对照。114 结果判断
11411 浸润细胞表型 在高倍镜下,每种单抗染片
随机取5个不同视野,用0115mm2
Π100格的目镜网
格测微尺计算100个方格内阳性细胞数,阳性细胞数以每平方毫米表示。
11412 ICAM21、LFA21、bFGF和TGF2β1 染色以
>75%细胞着色及颗粒粗大浓染为强阳性(7)
・509・
>50%细胞着色及颗粒均匀为阳性(6),>25%细
胞着色及颗粒细小为弱阳性(+),没有着染或着染
细胞数不足25%为阴性(-)。11413 Northernblot 用FujiBio影像扫描系统进行
RNA定量。结果以TGF2β1ΠGAPDH比率表示。
115 统计学处理 用SPSS611软件Kruskal2Wallis1和Mann2whitneyU检验进行统计学分析。
2 结果
211 HE染色显示 Allograft3个月和6个月组心肌
间质可见从局部到弥漫的,轻度到中度的单个核细胞浸润,心肌细胞肥大并伴有间质纤维化。浸润细胞主要分布在血管周围和心内膜下区。心肌各级血
管呈中度或重度向心性增厚及硬化。α2SMA染色,
可见大量的小血管平滑肌增生,血管腔狭窄或闭塞(见图1),呈现不同程度的慢性排斥损伤。Isograft组心肌只见轻度的局限性细胞浸润,个别小动脉管壁轻微增厚。212 免疫组化显示21211 各类免疫细胞在各组心肌的表达结果 见表1。CD45、CD4、CD8、TCR、CD45RB、巨噬细胞和NK细胞在Allograft3个月组和6个月组中表达均显著高于正常对照组(P<0105);Allograft3个月与Isograft组比较也显著升高(P<0101)。这些细胞主要分布在心肌间质、血管周围和心内膜下区域,并以T淋巴细胞和巨噬细胞为主。B淋巴细胞只在Al2lograft3个月组显著升高(P<0101)。两个Allograft组间比较,6个月组的CD4显著低于3个月组(P<0105);其余各类细胞在6个月组中均存在下降趋势,但无统计学差异。另外,Isograft组的CD45、CD4
图1 Allograft(3个月)大鼠心肌组织α2平滑肌肌动蛋白表达(免疫组织化学染色,×250)Fig11 Expressionofα2SMAon3monthsallograftofratheart
(Immunohistochemistry,×250)
Note:Smoothmusclecellsproliferating,severevascularwallthickening,naro2
owing.Infiltratingcellswerepredominantlyintheperivascularares.
・510・中国免疫学杂志2005年第21卷β图4 TGF21mRNANorthernblot分析图谱β1mRNAFig14 NorthernblotanalysisofTGF2
图2 Allograft(6个月)大鼠心肌组织bFGF表达(免疫组织
化学染色,×250)
Fig12 ExpressionofbFGFon6monthsallograftofratheart
(Immunohistochemistry,×250)
Note:Themajor215kbtranscriptincreasedsignificantlyby5to6foldin3
and6monthsallografts(P<0105).
2
表1 浸润细胞在各组心肌组织的表达(x±sΠmm)
Tab11 Expressionofsubpopulationsofinfiltratingcellsin
graftsandnormalhearts(x±sΠmm)
mAbCD45CD4CD8TCRCD45BRED1ED2ED3
Normal224±24162±1075±828±745±2084±14184±2372±132±1859±6
Isograft(3months)517±841)485±702)72±943±1044±8213±591)297±41255±512)
4±247±8
Allograft(3months)3300±3221)3)2800±3571)3)4)423±1241)3)578±1421)3)386±1001)3)935±981)3)325±126355±821)164±503)208±121)3)
Allograft(6months)2282±6281)1124±1981)423±861)393±981)289±841)971±2411)459±75300±9424±6164±331)
2
β图3 Allograft(6个月)大鼠心肌组织TGF21表达(免疫组
织化学染色,×250)
βFig13 ExpressionofTGF21on6monthsallograftofratheart
(Immunohistochemistry,×250)
BcellNKcell
Note:1)P<0105;2)P<0101vsnormalratheart;3)P<0101vsisog2
raft;4)P<01053monthsvs6months.
表2 黏附分子和生长因子在各组心肌组织表达的结果
Tab12 Expressionofadhesionmoleculesandgrowthfactorsingraftsandnormalhearts
ICAM21
GroupsAllograft(6months)Allograft(3months)Isograft(3months)Normal
3
100
100
100
100
9
4414
5516
2212
7718
5516
4414
3313
6617
6
8313
1617
3313
5010
1617
8313
1617
6616
1617
1617
n
LFA21
-(%)
3+(%)6010
2+(%)4010
1+(%)
-(%)
3+(%)4010
bFGF2+(%)6010
1+(%)
-(%)
3+(%)4010
βTGF21
2+(%)4010
1+(%)2010
-(%)
3+(%)6010
2+(%)2010
1+(%)2010
5
βNote:P<01056monthsvsnormal;P<01013monthsvsisograft;P>01053monthsvs6monthsandisograftvsnormalinICAM21,LFA21,bFGFandTGF21,
respectively.
和巨噬细胞(ED1)的表达显著高于正常对照组(分
别P<0105,P<0101,P<0105)。
β21212 ICAM21、LFA21、bFGF和TGF21结果 见表2。两个Allograft组中有80%以上的大鼠黏附分子
和生长因子染色均呈阳性和强阳性表达,Allograft6
个月组与正常对照组比较,Allograft3个月组与Isog2
raft组比较各类分子表达均显著增高(各P<0105和P<0101)。而正常组与Isograft组,Allograft3个月与6个月组比较均无明显的差异(分别P>0105)。黏附分子的阳性染色主要呈现在浸润细胞
张建军等 心脏移植慢性排斥反应机制的探讨 第7期和内皮细胞。bFGF和TGF2β1除了在浸润细胞有阳
性着色外,在增厚的血管平滑肌bFGF和TGF2β1表
达明显增强(见图2、3)。213 Northernblot分析 所有的样本(包括正常对
照组)均检测到TGF2
βmRNA(见图4)。Allograft3个月组和6个月组的TGF2β1mRNAΠGAPDH的比值比
正常对照组高5～6倍(0131±0105,0126±0106vs0105±01005,二者分别P<0105)。Allograft3个月组与Isograft组(0113±0103)比较也显著升高(P<0102)。而Isograft组与正常对照组间比较则无显著差异(P>0105)。
3 讨论
心脏移植的慢性排斥是移植1年后引起移植物
失活的主要原因1,2
,发病机制仍不清楚。目前,尽管许多学者提出了各种假说,但随着研究的不断深入,人们更加关注细胞免疫、炎症介质和细胞因子及其相关因素在移植心慢性排斥反应发病机制中所引起的重要作用。心脏移植慢性排斥的病理特征主要是移植心肌细胞肥大、间质纤维化。各级血管弥漫
性、向心性增厚,呈现动脉粥样硬化改变1,6
,故称心脏移植物血管病(CAV)。本实验AS鼠在移植前经DSBT治疗,可产生对供体心的耐受,使移植物存活3～6个月,并出现上述慢性排斥的病理特征。同时Allograft组心肌间质的浸润细胞显著升高,以T淋巴
细胞和巨噬细胞为主,这些浸润细胞主要分布在心肌间质、血管周围和心内膜下区域。T细胞受体的表达也显著增加,移植物细胞表面的同种异型MHC分子可以通过直接和间接途径提供给受者T细胞识别。近年的研究表明间接识别在慢性排斥中起重要作用,进入移植物内的受者APC可以吞噬和处理从移植物细胞脱落下来的同种异型MHC分子,并且通
过传统的外源抗原提呈途径提呈给T细胞7
。Hru2ban等8
发现在CAV的心脏移植物间质和冠状动脉
内皮下区域常存在来源于受者的单个核细胞,这些
浸润的细胞以CD4+、CD8+
T细胞和单核巨噬细胞为主,并且在移植心冠状动脉内存在特异性抗原反
应克隆扩增的T细胞9
,说明在移植心慢性排斥反应中存在异质原细胞免疫反应,并且在这反应中T细胞和巨噬细胞起主要的作用。
近年来的研究发现,在慢性排斥期间ICAM21、
LFA21、TGF2β1和bFGF的表达显著增加,并在心脏移植排斥反应的病理生理过程起重要作用
2,10,11
。
本研究的结果也显示:在Allograft大鼠ICAM21、LFA21、TGF2β1和bFGF表达比正常和Isograft大鼠明显增
・511・
加,并且在Allograft大鼠增厚的血管平滑肌bFGF和
TGF2β1表达明显增强。在慢性排斥中,免疫反应虽然没有急性排斥那样强烈,但仍然存在。炎症细胞通过微循环移行至移植物内,促进血管表达ICAM21和LFA21等黏附分子,这些黏附分子介导抗原提呈细胞与T细胞、T细胞与靶细胞接触及活化。活化的细胞可释放细胞因子和脂质等物质引起移植物内皮持续的低水平损伤,内皮细胞为保护自身的血管,
分泌包括TGF2β1、bFGF在内的各种生长因子,诱导
炎症细胞、T细胞、单核细胞和血小板在血管壁聚集,同时也诱导血管平滑肌细胞增殖和向内膜下迁
移,致使血管壁增厚、闭塞,形成CAV12
。
TGF2β1是一种强效免疫抑制因子,广泛参与免疫系统细胞之间的相互作用,抑制DC细胞的成熟,
影响胸腺细胞、T1B淋巴细胞、NK细胞的增殖分化,干扰B细胞各种免疫球蛋白的产生和转化,并通过
直接或间接影响IL21、IL22、IFN2γ的产生13,降低移植排斥反应,延长移植物的存活时间14
。另一方
面,它可通过增加细胞外基质成分的合成促进纤维化,参与移植后的血管病理性变化过程,并且TGF2
1表达的水平与血管病理改变的程度密切相关2
。在慢性排斥血管病理性变化过程中,损伤的内皮细胞和平滑肌细胞可释放大量的bFGF刺激血管内皮细胞、平滑肌细胞分裂、增生、向内膜下迁移和纤维化12
。本实验Allograft组的心肌内也可见到血管壁平滑肌极度增生,并向内膜下迁移,在增厚的血管壁
上有强的TGF2β1和bFGF表达,可见TGF2β1和bF2
GF参与了CAV的形成。但是否TGF2β1和bFGF是引起CAV的主要原因尚不能肯定。这些生长因子
及其相关因素之间的相互关系及其中的机制仍有待进一步研究。
在本研究中同基因移植组心肌间质可见轻度的细胞浸润,个别小动脉内膜轻度增厚,这可能是由于一些非免疫因素,如缺血、再灌注、外科损伤等引起的。这些损伤只是轻微的,它与慢性排斥所引起的血管损伤有明显区别。由此可见异质原免疫反应是CAV发生和发展的主要因素。
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(上接第507页)
表达低于正常组,证实蜕膜IDO正常表达是维持妊娠所必需;IDO对母胎界面Th1ΠTh2细胞因子平衡有一定调节作用,12MT可抑制IDO活性,使Th细胞因子平衡偏离Th2型,并随抑制剂剂量增加而明显,不利于维持妊娠;在IDO活性正常时,补肾中药对IDO活性及母胎界面Th1ΠTh2细胞因子的平衡均无
明显影响,因此不会导致母胎免疫异常;在IDO活性受到抑制的情况下,补肾中药可以提高IDO活性及改善母胎界面Th1ΠTh2细胞因子平衡,使之恢复正常水平,有利于正常妊娠的维持。
从本实验的结果可以推测:补肾中药通过促进蜕膜巨噬细胞IDO的表达和活性从而进一步调节母胎界面的免疫耐受,使其恢复到正常妊娠状态,从而起到维持早孕的作用。这些结果为流产发病机理以及补肾中药调节母胎界面内分泌2免疫网络的研究提供了一定的理论依据。本实验从人正常早孕蜕膜巨噬细胞和淋巴细胞的关系的角度出发,进一步研究补肾中药对母胎免疫的调节作用,发现IDO是母胎内分泌-免疫网络中的重要一环。但本实验未对蜕膜淋巴细胞进行具体分型,因此蜕膜巨噬细胞和不同类型蜕膜淋巴细胞之间的关系还有待于进一步阐明。
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(编辑 徐 杰)
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