蛋白与核酸作用检测1-Luciferase报告基因系统_修正版

编号：3-1

主题：Luciferase报告基因系统 概述：

Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。 原理简述如下:

(1)构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。

(2) 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。

(3) 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。 目的：

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检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用 步骤：

使用 Promega公司的Dual-luciferase Reporter Assay System进行检测: 1)取对数生长期的目的细胞，接种于24孔培养板中，继续培养16~24h,待细胞汇片至70~80%时进行转染；

2) 将Luciferase报告基因质粒、Renilla对照质粒及其它质粒（根据具体实验确定）共转染细胞。每组设3个平行孔，37°C，5%CO2条件下培养24h； 3)弃去培养基，用冰预冷的PBS洗2次，以除去残余培养基。每孔细胞加入100 μl 1X Passive Lysis Buffer，轻微振荡，室温 15 min；

4)打幵ModulusTM微孔板型多功能光度计，预热后，设置相应参数。自动注射器进样体积25 μl；注射后在读数前的延迟时间:2 s；检测的积分时间:10 s； 5)取20 μl裂解产物加入到96孔发光检测板中，放入发光测试仪读值。 6)拷贝检测结果,进行统计学分析； 7)相对转录效率的计算。 流程图：

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