猪MAVS基因原核表达载体的构建及其多克隆抗体的制备

Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｆｉｎａｕ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　中国兽医杂志２０１７年（第５３卷）第４期　３９　猪ＭＡＶＳ基因原核表达载体的　构建及其多克隆抗体的制备　赵倩楠　，应　雪　，李晓泉　，张珂　，李晓宁　，梁晶晶　，罗廷荣　（１．广西大学动物科学技术学院动物传染病研究室，广西南宁５３０００４；　２．广西大学亚热带农业生物资源保护利用国家重点实验室，广西南宁５３０００４）　摘要：通过ＲＴ—ＰＣＲ从ＰＫ一１５细胞系中扩增克隆ＭＡＶＳ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ａｎｔｉｖｉｒｌａ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）基因，构建原核表达载体　ｐＥＴ—ＭＡＶＳ２２０，转化感受态细胞Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３），利用ＩＰＴＧ诱导表达，重组ＭＡＶＳ经纯化后免疫４周龄昆明系小鼠制备抗线　粒体抗病病毒信号蛋白（ＭＡＶＳ）多克隆抗体。诱导表达的最佳条件为ＩＰＴＧ　０．０５　ｍｍｏｌ／Ｌ，３７　ｏＣ诱导６　ｈ，重组ＭＡＶＳ以可溶　性蛋白和包涵体两种形式表达。应用该重组蛋白免疫小鼠获得的抗ＭＡＶＳ多克隆抗体与纯化的重组ＭＡＶＳ蛋白反应效价　可达１：１６０００；该抗体与Ｐｏｌｙ（Ｉ：ｃ）刺激ＰＫ．１５细胞产生的ＭＡＶＳ及与转染了重组ＭＡＶＳ基因真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．０－ＭＡ—　ＶＳ的ＢＨＫ一２１细胞表达的ＭＡＶＳ蛋白发生特异性反应，效价可达１：１　０００，特异性良好。　关键词：猪ＭＡＶＳ；原核表达；多克隆抗体　中图分类号：￥８５８．２８　文献标志码：Ａ　文章编号：０５２９—６００５（２０１７）０４—００３９—０３　Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｓｐｅｃｉｉｃｉｔｆｙ　ｏｆｓｗｉｎｅ　ＭＡＶＳ　ｂｙ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ＺＨＡＯ　Ｑｉａｎ—ｎａｎ　，ＹＩＮＧ　Ｘｕｅ　，ＬＩ　Ｘｉａｏ．ｑｕａｎ　，ＺＨＡＮＧ　Ｋｅ　，　ＬＩ　Ｘｉａｏ．ｎｉｎｇ　，ＬＩＡＮＧ　Ｊｉｎｇ－ｊｉｎｇ　，－，ＬＵＯ　Ｔｉｎｇ．ｒｏｎｇ　（１．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｕａｎｇｘｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｎａｎｎｉｎｇ　５３０００４，Ｃｈｉｎａ；２．Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｆｏｒ　Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ　Ａｇｒｏ—ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，　Ｇｕａｎｇｘｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｎｉｎｇ　５３０００４，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ＭＡＶＳ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｉｅｄ　ｆｆｒｏｍ　ＰＫ．１５　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ＲＴ．ＰＣＲ　ａｎｄ　ｗａｓ　ｔｈｅｎ　ｓｕｂｅｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｐＥＴ－ＭＡＶＳ２２０．Ｔｈｅ　ｐＥＴ－ＭＡＶＳ２２０　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ａｎ　Ｅ．ｃｏｌ　Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３　ｔｏ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＭＡ．　ＶＳ　ｖｉａ　Ｉ　Ｇ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＭＡＶＳ　ｗａｓ　ｐｕｒｉｉｆｅｄ　ａｎｄ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｍｍｕｎｉｚｅ　ｔｈｅ　ｆｏｕｒ　ｗｅｅｋ　Ｋｕｎｍｉｎｇ　ｍｉｃｅ　ｔｏ　ｐｒｅｐａｒｅ　ａｎｔｉ．ＭＡ．　ＶＳ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＥＴ—ＭＡＶＳ２２Ｏ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｅ　ｃｏｌ　Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ＭＡＶＳ　ｗａｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｂｙ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　０．０５　ｍＭ　Ｉｐ，ｒＧ　ａｔ　３７　ｏＣ　ｆｏｒ　６　ｈ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＭＡＶＳ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｔｗｏ　ｆｏｒｍｓ　ｏｆ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ／ｏｒ　ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ．Ｔｈｅ　ｐｕｒｉｉｆｅｄ　ＭＡＶＳ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｍｍｕｎｉｚｅ　ｔｈｅ　ｆｏｕｒ—ｗｅｅｋ　Ｋｕｎｍｉｎｇ　ｍｉｃｅ　ｔｏ　ｐｒｅｐａｒｅ　ａ　ｐｏｌｙｅｌｏｎａｌ　ａｎｔｉ．　ｂｏｄｙ．Ｔｈｅ　ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｔｉ．ＭＡＶＳ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｗｉｔｈ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ＭＡＶＳ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ　ｔｏ　ｒｅａｃｈ　ａ　ｈｉｇｈ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌ：１６０００，ａｎｄ　ｒｅａｃｈ　ａ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌ：１０００　ｗｉｔｈ　ＭＡＶＳ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｅ　ＰＫ．１５　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）ａｎｄ　ｉｎ　ＢＨＫ－２１　ｃｅｌｌｓ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｔｈ　ｔｈｅ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐｅＤＮＡ３．０一ＭＡＶＳ．Ｔｈｅ　ａｎｔｉ－ｓｗｉｎｅ　ＭＡＶＳ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｓｈｏｗｅｄ　ａ　ｈｉｓｈ　ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｐｅｅｉｉｆｃｉｔｙ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｓｗｉｎｅ　ＭＡＶＳ；Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：ＬＵ０　Ｔｉｎｇ．ｒｏｎｇ　固有免疫是机体抵抗外来病毒等微生物入侵的　第一道防线。线粒体抗病病毒信号蛋白（ｍｉｔｏｃｈｏｎ．　ａｌ　ａｎｔｉｖｉｒａｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＡＶＳ）是ＲＬＲ（ＲＩＧ．Ｉ．　因子的激活　，从而诱导机体抗病病毒免疫反应　Ｊ。　ＮＬＲ家族的ＮＬＲＸ１（又叫ＮＯＤ９）定位于线粒体外膜，　能与ＭＡＶＳ相互作用，抑制ＭＡＶＳ介导的抗病病毒免　疫反应　。ＥＹＡ４（ｅｙｅｓ　ａｂｓｅｎｔ　４）与ＭＡＶＳ结合并对　ＭＡＶＳ介导的ＩＦＮ．Ｂ的表达至关重要　Ｊ。ＳＡＲＳ—ＣｏＶ　１ｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）信号通路中关键的接头蛋白…。在病　毒感染过程中，胞内受体ＲＬＲ识别病毒ｄｓＲＮＡ，经　ＭＡＶＳ传递引起下游ＮＦ－ＫＢ和ＩＲＦ－３等一系列细胞　收稿日期：２０１５－１０－２１　基金项目：广西自然科学基金重点项目（２ｏｌ２ＧｘＮｓＦＤＡ０５３００９）；国　家自然科学基金项目（３１４６０６５３）　的ＯＲＦ３ｂ和ＯＲＦ６两个蛋白定位于线粒体，可以与　ＲＩＧ－１或者ＭＡＶＳ结合从而抑制ＩＦＮ的产生　。　ＨＣＶ通过具有Ｓｅｒ．蛋白酶体活性的ＮＳ３／４切割ＭＡ．　Ｖｓ第５０８位半胱氨酸，造成ＭＡＶＳ不能正确定位在　线粒体外膜上，不能诱导产生Ｉ型干扰素，成为ＨＣＶ　逃避宿主免疫机制的策略之一　。　目前，养猪业是我国重要的支柱产业之一，但　作者简介：赵倩楠（１９８９一），女，硕士，研究方向为动物传染病　防治与分子病毒学，Ｅ．ｍａｉｌ：５２４６５６０５２＠ｑｑ．ｃｏｒｎ　通讯作者：罗廷荣，Ｅ—ｍａｉｌ：１２９４７８３７５＠ｑｑ．ｃｏｒｎ　４０　中国静医杂志２０１７年（第５３卷）第４期　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｍａｌ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　常受到猪瘟病毒、猪呼吸与繁殖障碍病毒、口蹄疫　病毒等的侵害，造成巨大的经济损失。为了进一步　研究猪体内ＭＡＶＳ在病毒感染过程中的免疫应答　作用，需要应用抗猪ＭＡＶＳ抗体，而该抗体正是目　前全世界的生物制品市场中所缺乏的。本试验通　特异性抗体。四免后第７天采血，收集血清。　１．６　多克隆抗体与猪ＭＡＶＳ特异性鉴定　培养　ＢＨＫ－２１细胞至融合状态时参照脂质体２　０００转染　试剂盒说明书转染ｐｃＤＮＡ３．０－ＭＡＶＳ真核表达载　体，转染后２４　ｈ收集细胞总蛋白进行Ｗｅｓｔｅｒｎ—Ｂｌｏｔ。　培养ＰＫ一１５细胞至融合状态时加入５Ｏ　ｇ　Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）　刺激细胞，２４　ｈ后收集细胞总蛋白进行Ｗｅｓｔｅｒｎ—Ｂｌｏｔ。　２结果　过构建猪ＭＡＶＳ基因原核表达载体，表达纯化出重　组ＭＡＶＳ蛋白，免疫小鼠从而制备获得特异性高的　抗猪ＭＡＶＳ多克隆抗体，为进一步研究猪ＭＡＶＳ与　猪病毒性疾病之问的相互作用机制奠定良好基础。　１材料与方法　１．１　主要试验材料ＰＫ一１５细胞系、ＢＨＫ－２１细胞　２．１　原核表达载体ｐＥＴ—ＭＡＶＳ２２０构建利用引物　Ｆ和Ｒ，对重组质粒ｐＭＤＩ８－Ｔ—ＭＡＶＳ进行ＰＣＲ扩　增，构建获得ｐＭＤ１８一Ｔ．ＭＡＶＳ２２０重组质粒，将其双　酶切后连接ｐＥＴ－３２　ａ（＋），转化感受态细胞　ＴＯＰ１０，ＰＣＲ鉴定结果为阳性（图１Ａ），质粒双酶切　也得到预期目的条带（图１Ｂ），测序结果正确。　Ｍ　２　系、ｐＥＴ．３２　ａ（＋）质粒由广西大学亚热带农业生物　资源保护利用国家重点实验室保存提供；４周龄昆　明系小鼠，购自广西医科大学实验动物中心。　１．２引物设计与合成根据ＧｅｎＢａｎｋ中发表的猪　ＭＡＶＳ基因序列（登录号：ＮＭ一００１０９７４２９），对ＭＡ・　ＶＳ多肽的亲疏水性和线性表位等指标进行了分析，　选取ＭＡＶＳ基因序列１　０１８一ｌ　６７７共６６０　ｂｐ作为原　核表达的目的基因，设计亚克隆引物Ｆ：５　一ｃｇｇａａｔ—　ｔｃａｇｃａｔｇｇｔｇｃｃｃｔｃｔａａａ－３　；Ｒ：５　一ｃｇｃｔｃｇａｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔ・　ｇｃｃａｃｇｇａｇｃｃｃｔａｇｃｃｔｃ一３　。　Ａ　Ｓ　Ｂ　１．３构建原核表达载体ｐＥＴ—ＭＡＶＳ２２０　本实验　室前期经ＲＴ—ＰＣＲ从ＰＫ一１５细胞中扩增出全长ＭＡ—　图１猪ＭＡＶＳ原核表达载体的鉴定　Ａ：鼋组质粒ｐＥＴ—ＭＡＶＳ２２０转化ＴＯＰ１０茼液ＰＣＲ鉴定；　Ｖｓ基因，克隆至ｐＭＤ１８－Ｔ载体并构建了其真核表　达载体ｐｃＤＮＡ３．０一ＭＡＶＳ（添加了ｃ．Ｍｙｃ标签）。用　分别带有酶切位点ＥｃｏＲ　Ｉ与Ｘｈｏ　Ｉ的引物Ｆ和Ｒ对　重组质粒ｐＭＤＩ８－Ｔ—ＭＡＶＳ进行ＰＣＲ扩增，连接　Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ－２　０００；ｌ：露组质粒ｐＥＴ—ＭＡＶＳ２２０转化ＴＯＰ１　０　菌液ＰＣＲ扩增产物；Ｂ：霞组质粒ｐＥＴ—ＭＡＶＳ２２０酶切鉴定；　Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ－５　ｏｏｏ；２：藿组质粒ｐＥＴ—ＭＡＶＳ　２２０酶切产物　２．２重组菌诱导及其表达形式的鉴定取未诱导　ｐＭＤＩ８．Ｔ载体，获得重组质粒ｐＭＤ１８－Ｔ—ＭＡＶＳ２２０，　将其双酶切后亚克隆至原核表达载体ｐＥＴ一３２　ａ　（＋），ＰＣＲ鉴定和酶切鉴定后菌液送测。　及诱导的重组菌菌液各１　ｍＬ离心，菌体处理后用于　ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳，结果表明，重组载体表达出约４３　ｋＤ的融合蛋白，且ＩＰＴＧ终浓度为０．０５　ｍｍｏｌ／Ｌ时　诱导表达效果较好（图２）。诱导的重组菌超声波破　碎后分别收集上清和沉淀进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳，结　果表明，３７　ｏＣ、ＩＰＴＧ　０．０５　ｍｍｏｌ／Ｌ时，获得的重组蛋　１．４重组蛋白的表达及纯化将ｐＥＴ—ＭＡＶＳ２２０转　化至Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）感受态细胞中，３７　ｏ【＝２００　ｒ／ｍｉｎ　培养至菌液光密度值（ＯＤ６ｏｏ）达０．６，加入ＩＦＩ＇Ｇ至　终浓度分别为０．０５　ｒｅｔｏｏｌ／Ｌ和０．５０　ｍｍｏｌ／Ｌ，３７℃　白以可溶性蛋白和包涵体两种形式表达，且可溶性　蛋白稍多于包涵体，而ＩＰＴＧ终浓度为０．５　ｍｍｏｌｆＬ　诱导６　ｈ。取诱导表达产物进行ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳分　析，以确定目的蛋白原核表达的最佳条件。超声波　时重组蛋白仅以包涵体形式表达（图２）。　２．３重组蛋白的纯化与鉴定　将Ｎｉ—ＮＴＡ亲和层　析纯化过程中收集的上清、穿透液、２次洗涤液、５次　蛋白洗脱液进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳，结果表明，目的蛋　白与Ｎｉ．ＮＴＡ亲和层析柱结合良好；含７０　ｍｍｏＬ／Ｌ咪　唑的ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ可洗涤部分杂蛋白，达到洗涤目的；　破碎法裂解菌体，离心后分别收集上清与菌体沉淀　进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳分析，鉴定重组蛋白的表达形　式。然后用Ｎｉ—ＮＴＡ亲和层析柱纯化可溶性蛋白。　１．５猪ＭＡＶＳ多克隆抗体制备纯化蛋白透析后　与弗氏佐剂混合乳化免疫４周龄昆明系小鼠，采用　第ｌ、７、２ｌ、３５天背部皮下多点注射的方式进行免　含２５０　ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑的Ｅｌｕｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ可以洗脱全部　目的蛋白（图３Ａ）。Ｗｅｓｔｅｒｎ—Ｂｌｏｔ鉴定透析后洗脱蛋　白的Ｈｉｓ标签（图３Ｂ），说明成功获得ＭＡＶＳ重组　蛋白　疫，每只小鼠蛋白免疫量约５００　ｔｘｇ。三免后第７天　随机选一只小鼠收集少量血清，Ｗｅｓｔｅｒｎ—Ｂｌｏｔ检测多　克隆抗体与重组蛋白的反应性，鉴定小鼠是否产生　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　中国兽医杂志２０１７年（第５３卷）第４期４Ｉ　Ｍ　ｌ　２　３　Ｍ　４　５　６　７　８　９　Ｍ　１　Ｍ　２　Ｍ　３　Ｍ　４　６６　４５　ＭＡＶＳ重　３５　组蛋白　图２　ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析重组茵　ｐＥＴ－ＭＡＶＳ２２０表达的ＭＡＶＳ　Ｍ：蛋ｎ分子量标准；１：未诱导蘑组菌；２／４和３／７：分圳为　０．０５　ｍｍｏｌ／Ｌ、０．５　ｒａｍ（ｄ／ＬＩＰＴＧ　３７℃诱导重组菌６　ｈ后的全蔺；　５和８：分别为０．０５　ｍｍｏｌ／Ｌ、０．５　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ诱导重组蔺６　ｈ　后裂解茼休得到的Ｉ　清；６和９：分别为０．０５　ｍｍｏｌ／Ｌ、０．５　ｍｍｏｌ／Ｉ　ＩＰＴＧ诱导蕊纰蒲６　ｈ后裂解菌体得到的沉淀　！、Ｉ　Ｉ　２　３　４　５　６　７　９　图４　Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ检测ＭＡＶＳ多克隆　抗体与ＭＡＶＳ重组蛋白的反应性　Ｍ：蛋白分子　标准；１～４：分圳为Ｉ：２　０００、　１：４０００、ｌ：８　０００和１：１６０００稀释抗体　Ｍ　ｌ（Ｄ　６６。。。。。。。——　一　—　．．　Ｌ　～董　组蚩臼　。　一３Ｓ——　■ｌ一　■睡　●ｌ　■●一一　—■｜Ｂ　．　Ｉ、Ｉ　ｌＩＩ　ｋＤ　Ｓ一　　ａｃｔｉｎ　Ｉ、Ｉ．　。　重　图５　Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ检测ＭＡＶＳ多克隆　抗体与真核细胞表达ＭＡＶＳ蛋白的特异性　Ａ：Ｗｅｓｔｅｒｎ—Ｂｌｏｔ检测ＭＡＶＳ多克隆抗体　ｊ　ＢＨＫ一２１细胞表达外源　ＭＡＶＳ蛋　的特异性；Ｂ：Ｗｅｓｔｅｒｎ．Ｂｌｏｔ愉｛！ｌ！ＩＩ　ＭＡＶＳ多踅降抗体　ｊ　组蚩臼　３Ｓ　Ｂ　ＰＫ一１５细胞表达ＭＡＶＳ蛋白的特肄性　Ｍ：蛋ｎ分子培标准；　Ⅲ　１：术转染的ＢＨＫ－２ｌ细胞蛋白；２：转染ｐｅＤＮＡ３．０－ＭＡＶＳ的　图３纯化ＭＡＶＳ重组蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析　Ａ：纯化ＭＡＶＳ重组蛋ｒＩ的ＳＤＳ—ｔ’ＡＧＥ分析　Ｂ：Ｗｅｓｔｅｒｎ．Ｂｌｏｔ鉴定纯化的ＭＡＶＳ重组蛋白　Ｍ：蛋Ｆｔ分子皱标准；１：重组菌裂解后上清中的ＭＡＶＳ蛋ｎ；　２：穿透液；３、４：７０　ｒｅｔｏｏｌ／Ｌ咪唑洗涤液；５—９：２５０　ｒｅｏｔｏｌ／Ｌ咪Ｉ雌洗　脱液Ｍ收的ＭＡＶＳ蛋自；１０：纯化后的ＭＡＶＳ重组蛋Ｆｊ　ＢＨＫ－２１细胞蛋白；３：Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）处理的ＰＫ—ｌ５细胞　４：未处　的ＰＫ　１５细胞蛋白　：　３讨论　猪ＭＡＶＳ基因ＯＲＦ编码一个由５２４个氨基酸　构成的跨膜蛋白，其Ｎ端含有一个ＣＡＲＤ结构域。　２．４猪ＭＡＶＳ多克隆抗体与重组蛋白的反应性　ＲＩＧ—Ｉ和ＭＤＡ５识别人侵病毒的ＲＮＡ后，通过　ＣＡＲＤ结构域与接头蛋白ＭＡＶＳ直接相互作用，将　将小鼠三免血清按不同比例稀释与ＭＡＶＳ重组蛋白　反应进行Ｗｅｓｔｅｒｎ—Ｂｌｏｔ，结果表明，ＭＡＶＳ多克隆抗体　与ＭＡＶＳ重组蛋白的反应性很好，可达１：１６　０００稀释　（图４）。　信号传递到下游。由此可见ＭＡＶＳ在ＲＬＲ信号。　通路中的作用至关重要。本研究对猪ＭＡＶＳ基因　编码蛋白的抗原指数和亲水性以及线性表位等指　标进行了分析，同时考虑到原核表达系统中长片段　外源基因的插入可能导致目的蛋白不表达或表达　量低，故选取猪ＭＡＶＳ基因序列ｌ　０１８～１　６７７共６６０　２．５　多克隆抗体与真核细胞表达蛋白ＭＡＶＳ的特　异性收集转染ｐｃＤＮＡ３．０一ＭＡＶＳ真核表达载体的　ＢＨＫ－２１细胞蛋白和Ｐｏｌｙ（Ｉ：ｃ）处理的ＰＫ一１５细胞蛋　白进行Ｗｅｓｔｅｒｎ—Ｂｌｏｔ，成功检测到ＢＨＫ－２１细胞表达的　ｂｐ作为目的基因。片段与表达载体上的６　Ｘ　Ｈｉｓ．ｔａｇ　融合，表达出一个约４３　ｋＤ的硫氧还原融合蛋白，从　而提高可溶性蛋白的产量，同时利于Ｎｉ—ＮＴＡ亲和层　析纯化蛋白。　ＭＡＶＳ蛋白（图５Ａ）和ＰＫ一１５细胞表达的ＭＡＶＳ蛋白　（图５Ｂ），多克隆抗体效价可达１：ｌ　０００，表明制备的　抗猪ＭＡＶＳ多克隆抗体特异性良好。　４２　中国兽医杂志２０１７年（第５３卷）第４期　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　鸡痛风的组织病理学观察　周　伟，谭云，王小波　（扬州大学兽医学院江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州２２５００９）　摘要：对江苏某蛋鸡养殖场发生内脏型痛风的病鸡进行病理学观察，结果显示，患鸡内脏器官表面沉着了大量白色石　灰状尿酸盐，肾脏、肝脏和脾脏切面上可见密布的白色结节；内脏器官的组织切片内可见痛风结节，但以肾脏病理变化较重；　此外，在不同组织的大血管壁周围可见大量尿酸盐沉积，暗示尿酸盐沉积可影响机体的血液循环，促进病鸡的发病死亡。　关键词：蛋鸡；痛风；尿酸盐　中图分类号：￥８３１．７　文献标志码：Ａ　文章编号：０５２９—６００５（２０１７）０４—００４２—０２　家禽痛风主要是由家禽的肾脏受损而造成尿　酸或尿酸盐沉积引起的，可影响家禽的正常生长和　蛋白及嘌呤类饲料含量过高、维生素Ａ缺乏等是弓　起痛风的最主要原因。　１材料与方法　］　］　发育，造成产蛋率下降，给养殖户带来巨大的经济　损失。家禽痛风广泛分布于世界各地的养禽场，主　要常见于鸡、水禽、火鸡等，无季节性，以群发为主，　尤其是肉仔鸡和笼养鸡多发，母鸡比公鸡多发。痛　风病因极其复杂，Ｇｕｏ等报道，引起鸡痛风的原因高　１．１病料２０１５年１１月江苏省东台市安丰镇养　殖户共饲养杂种蛋鸡４　０００只，８月龄，１２～１６日龄　使用过ＩＢＤ苗６倍量饮水，分别在３０日龄和９０日　龄使用过Ｈ５＋Ｈ９苗。饲料配方：玉米３１．５　、豆　饼７．５　ｋｇ、鱼粉２．５　ｋｇ、贝壳粉４　ｋｇ、酵母粉预混料　２．２５　ｋｇ。病程３个月，曾经使用过中药治疗，但效　果不理想。共送检６只病鸡。　达２０多种，特别是营养因素，日粮中钙含量过高、核　收稿日期：２０１６－０５—１９　基金项目：江苏高校优势学科建设工程资助项目（ＰＡＰＤ）；江　苏高校品牌专业建设工程资助项目（ＰＰＺＹ２０１５Ｂ１５８）　作者简介：周伟（１９９６一），男，本科生，就读于预防兽医专业，　Ｅ－ｍａｉｌ：４４７７１７４９７＠ｑｑ．ｔｏｍ　１．２样品采集和固定对送检的病鸡进行临床症　状观察，剖检濒死病鸡，观察并记录剖检病变。采　集病鸡的心脏、肝脏、肾脏、脾脏和十二指肠，置于　‘　～　ｅ　、、　‘　、、　通讯作者：王小波，Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｎｇｘｂ＠ｙｚｕ．ｅｄｕ．ｅｎ　＾　一、　、　ｐ‘　。’　ｐ～　、　、＇　、　猪ＭＡＶＳ与人ＭＡＶＳ的氨基酸同源性很低，只有　Ｙｏｎｅｙａｍａ　Ｍ，Ｋｉｋｕｅｈｉ　Ｍ，Ｎａｔｓｕｋａｗａ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ＲＮＡ　ｈｅｌｉｅａｓｅ　４８．８％，而生物市场上又缺乏商品化的抗猪ＭＡＶＳ抗　体。本研究成功对猪ＭＡＶＳ基因进行了克隆和原核　表达，并制备出具有较高特异性的小鼠抗猪ＭＡＶＳ多　ＲＩＧ．Ｉ　ｈａｓ　ａｎ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｆｕｎｅｔｉｏｎ　ｉｎ　ｄｏｕｂｌｅ．ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＲＮＡ．ｉｎｄｕｃｅｄ　ｉｎｎａｔｅ　ａｎｔｉｖｉｒａｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４，５（７）：７３０—７３７．　Ｍｏｏｒｅ　Ｃ　Ｂ，Ｂｅｒｇｓｔｒａｌｈ　Ｄ　Ｔ，Ｄｕｎｃａｎ　Ｊ　Ａ，ｅｔ　ａ１．ＮＬＲＸ１　ｉｓ　ａ　ｒｅｇｕｌａ－　ｔｏｔ　ｏｆ　ｍｉｔｏｅｈｏｎｄｒｉａｌ　ａｎｔｉｖｉｒａｌ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００８，４５１　（７１７８）：５７３－５７７．　Ｏｋａｂｅ　Ｙ，Ｓａｎｅ　Ｔ，Ｎａｇａｔａ　Ｓ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｎａｔｅ　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅ—　克隆抗体，该抗体与大肠杆菌表达的重组ＭＡＶＳ蛋白　反应效价可达１：１６　０００，与真核细胞ＰＫ－１５和ＢＨＫ一　２１表达的ＭＡＶＳ蛋白反应效价可达１：１　０００，为进一　ｓｐｏｎｓｅ　ｂｙ　ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ—ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｏｆ　Ｅｙｅｓ　ａｂｓｅｎｔ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００９，　４６０（７２５４）：５２０－５２４．　Ｊｅｓｓｉｅａ　Ｊ　Ｃｈｉａｎｇ，Ｍｅｒｅｄｉｔｈ　Ｅ　Ｄａｖｉｓ，Ｍｉｃｈａｅｌａ　Ｕ　Ｇａｃｋ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　步研究猪ＭＡＶＳ与猪病毒性疾病之间的相互作用机　制奠定了基础。　参考文献：　［１］Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　Ａ　Ｊ，Ｌｏｅａｒｎｉｎｉ　Ｓ　Ａ．Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ　ｒｅｅｅｐｔｍ￣，ＲＩＧ－Ｉ—ｌｉｋｅ　ＲＮＡ　ｈｅｌｉｃａｓｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｖｉｒａｌ　ｉｎｎａｔｅ　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，２００７，８５（６）：４３５—４４５．　ｏｆ　ＲＩＧ—Ｉ—ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｂｙ　ｈｏｓｔ　ａｎｄ　ｖｉｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ＆Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，２０１４，２５：４９１—５０５．　Ｗｅｌｓｃｈ　Ｃ，Ｈａｓｅｌｏｗ　Ｋ，Ｇｏｕｔｔｅｎｏｉｒｅ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　ｖｉｒｕｓ　ｖａｉｌ—　ａｎｔｓ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｔｏ　ｍａｅｒｏｃｙｅｌｉｅ　ＮＳ３－４Ａ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｓｕｂｖｅ￣ＩＦＮ・Ｂ－ｉｎ　ｄｕｅｔｉｏｎ　ｂｙ　ｅｆｉｃｉｆｅｎｔ　ＭＡＶＳ　ｃｌｅａｖａｇｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｈｅｐａｔｏｌ，２０１５，６２（４）：　７７９－７８４。　［２］杨星星，王凯，陈晓娟，等．线粒体抗病毒信号蛋白（ＭＡＶＳ）在　宿主天然免疫信号通路中的调节作用［Ｊ］．生物化学与生物物　理进展，２０１３，０５：３９７－４０５．　Ｍｅｙｌａｎ　Ｅ，Ｃｕｒｒａｎ　Ｊ，Ｈｏｆｍａｎｎ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｃａｒｄｉｆ　ｉｓ　ａｎ　ａｄａｐｔｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＲＩＧ－Ｉ　ａｎｔｉｖｉｒａｌ　ｐａｔｈｗａｙ　ａｎｄ　ｉｓ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｂｙ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　ｖｉｒｕｓ　［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３７（７０６２）：１　１６７—１　１７２．