腮腺炎病毒空斑纯化实验protocal
一、实验目的
对腮腺炎病毒进行纯化，得到基因组相同的腮腺炎病毒。
二、实验原理
病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，接种的病毒液要充分分散和稀释。
三、实验材料
KMB17(人二倍体成纤维细胞)，DMEM，BCS（小牛血清），1％胰酶，低熔点琼脂糖，巴氏管，六孔板，二十四孔板，恒温水浴锅，37摄氏度细胞培养箱，KMB17(人二倍体成纤维细胞)
四、实验步骤
1，用1％胰酶将已长满的KMB17细胞消化后均匀接种于六孔板,每孔1*105细胞，培养基为8％的BCS的DMEM培养基。
2，待细胞长到80-90％时，用梯度稀释的腮腺炎病毒（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5）各200ul进行感染，阴性对照加200ul的DMEM溶液，置于37℃吸附30min后弃去残夜。
3，加入121℃ 15min高压灭菌后在55℃温浴的0.8％的低熔点琼脂糖的DMEM溶液，每孔加入2ml，待琼脂凝固后将培养板倒置放于37℃培养。
4，8-10天后在显微镜下观察蚀斑形成情况，并标记相应区域，用巴氏管吸取5个蚀斑块到1.5ml离心管中，加入1ml的DMEM培养基。
5，将200ul含有病毒的斑块接种于KMB17细胞中，补充培养基到每孔2ml。
6，37℃培养7-8天，选取病变完全的细胞孔进行传代扩增。
7，扩增后的病毒收获液按照以上方法重新纯化一次。
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容