载体构建流程

载体构建SOP流程:

GenBank查询目的基因序列→根据ORF序列利用引物设计软件设计引物→表达目的基因的组织或细胞总RNA提取→RT-PCR获取目的基因→酶切目的基因和载体→分别纯化酶切的目的基因和载体并建立连接反应→转化→初步筛选阳性克隆→阳性克隆测序→测序正确的质粒保种并重提质粒

I.获取目的基因/序列片段

一.获取序列信息

通过GENBANK数据和生物信息的方法设计目的基因或目的片段引物（shRNA、RNA）。

PCR引物的设计原则：

① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

② 产物不能形成二级结构。

③ 引物长度一般在15~30碱基之间。

④ G+C含量在40%~60%之间。

⑤ 碱基要随机分布。

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-

⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。

⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。

⑧ 引物5′端可以修饰。

⑨ 引物3′端不可修饰。

⑩ 避免在引物的3’端使用碱基A。

在实际设计引物中由于ORF两末端序列本身的限制，不能完全按照上述理想的设计原则，但也切记引物不能过长或过短。过长的引物不容易打开其二级结构，与模板结合缓慢，也容易形成引物二聚体，通常不超过35bp(不包括酶切位点和保护碱基)。过短的引物特异性差，扩出其它不相关片段，最终很难得到目的片段，通常不短于18bp(不包括酶切位点和保护碱基)。要将目的基因定向克隆至相应载体，需要在上下游引物两端设计不同的酶切位点，由于酶切位点位于线性末端时酶对其识别切割能力大大降低，需依据NEB目录添加相应保护碱基，酶切时可相应增加时间。

二.制备模板

1.分离高质量RNA：成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。现在实验室通常使用Trizol试剂法提取总RNA，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg

组织中提取RNA。在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNase A，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase。制备好的RNA应立即RT合成cDNA，若不马上使用应立即存于-80℃冰箱。也可以在细胞或组织加入Trizol试剂后立即冻入-80℃冰箱，待用时再制备。我们通常都是从组织或细胞中提取RNA。从细胞提取RNA是要掌握细胞的量，注意Trizol加量，从组织中提取RNA研磨过程液氮一定不能干，尽量研碎，速度要快，提完后立即进行下步反应。

对扩增片段较长、丰度较低、复杂度较高的片段，对RNA质量要求很高，可采取oligo dT纤维柱制备较纯的mRNA,有利于制备高质量的cDNA。

防止RNA酶污染的措施： 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间； 塑料器皿可用% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）；我们实验室采取连续高压两次，效果也不错；有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用% DEPC水冲洗，晾干；配制的溶液应尽可能的用% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经μm滤膜过滤除菌；操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换；设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。

制备cDNA:

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（1）反转录酶的选择

a． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。

b． 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。

c．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。

d．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。

（2）合成cDNA引物的选择

a．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。

b．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂

性方面均要小。

c．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。

三.扩增目的片段

高保真酶扩增目的片段，优化PCR条件获取特异的高保真的条带,由于此步为获取正确的目的基因，所以尽量避免PCR的突变格外重要。其中所采取的措施有：使用高保真酶、循环次数控制在25cycle左右、引物设计合理等。

PCR常出现三种情况：

1. 假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致， 有时其条带更整齐，亮度更高。

2. 出现非特异性扩增带：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

3. 什么条带都没有。

出现状况的原因和解决方法：

1. 假阳性的原因及解决方法：可能引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太

短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。还有就是靶序列或扩增产物的交叉污染 。

2. 非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。

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3. 什么条带都没有，其原因可能是少加东西，酶已经失活了，或退火温度太高，模板的质量问题等。解决方法：检查是否少加东西了，换一下酶，降低退火温度或做个梯度，摸一下条件。可以相应地提高Mg2+的浓度。如果再扩不出来可以考虑二次PCR。

II. 获取阳性克隆

一.酶切

1. 将双酶切的目的基因定向克隆入载体并转化。使用高质量无核酸酶污染的限制性内切酶（如NEB，fermentas）,20μl体系（2μgDNA）加μl 10U/μl的酶消化小时，可根据DNA浓度、酶的活力、酶的量、反应时间可适当改变条件，PCR产物酶切时间可增至2-3小时。酶切反应时避免星活性，导致星号活性的因素：较高甘油浓度（不超过10%）、低盐浓度（<25 100u/ug DNA、有机溶剂、其它二价

离子。

2. 双酶切两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切；温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的；只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的活性；先用难切的酶切，电泳鉴定确定切开，再用第二个酶切，以防单酶切，也可以去磷酸化。

3. 单酶切一定要去磷酸化。

4. 酶切跑电泳时，要酶切前和酶切后一起跑，有必要时跑个Marker。

5. 酶切完，纯化时为了提高纯化回收率，可以适当地外加一点NaAc，注意NaAc的pH 值要在。

常见的问题及原因

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二.连接

对于有效的连接体系来说合适的载体和目的基因分子数比值控制在一定范围内是有必要的，这个比值为1：3-1：10，较大的片段可适当提高比值。连接时，PCR产物浓度可以尽可能的大。连接通常是16℃或4℃过夜连接。

PCR产物最好进行切胶回收纯化，以去除PCR产物中的非特异性片段和引物等杂质。

切胶回收PCR产物时，避免DNA在紫外线下暴露时间过长从而形成嘧啶二聚体，造成PCR产物不能连接。

三.转化

复苏对于氨卞和氯霉素抗性不是必须的，但对卡那霉素则是必须的，42℃热激对转化率的影响较大，DH5A/TOP10转化率较高可适当少加些产物。对于慢病毒载体在DH5A/TOP10中易发生重组导致克隆失败，可选择Stbl系列的感受态细胞转化，以确保克隆的正确性，但要注意其转化率较低的问题，可以采用电转化或优化感受态的方式。

基本步骤：

（1）将100μl感受态细胞于冰上解冻。

（2）取5μl连接产物或～2μl质粒加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀内容物。 在冰上放置30分钟。

（3）将管放入预加温到42℃的水浴中，热激90秒。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2分钟。

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（4）每管中加700μl LB培养基，37℃振荡培养1小时，进行复苏。

（5）室温4,000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。注意：细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行

调整。

（6）将平板置于室温直至液体被吸收。

（7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。

转化常出现的结果及解决方法：

（1）板上什么都没有长出来：首先要考虑感受态细胞有没有问题，可以将感受态细胞涂于无抗性的LB培养板上，看是否长；再者要看一下抗性有没有搞错；最后再确定一下是不是去磷酸化去过头了。

（2）长的满板都是菌落：首先要考虑感受态细胞有没有被污染，验证方法是将感受态细胞涂于有抗性的板上，看是否会长菌；再考虑是否是载体酶切不完全，单酶切。

四.鉴定阳性重组子

快速菌落PCR：初步鉴定阳性子，一定要做阴性对照。

酶切鉴定阳性克隆：接种阳性克隆，提质粒，酶切再次鉴定阳性子。

对于难于克隆的基因需要先克隆入克隆载体（ENTRY CLONE）,再将其导入表达载体，也可以尝试非经典的克隆方法（GATEWAY技术-invotragen）。

五.测序

ORF序列不允许出现插入、缺失、改变氨基酸的点突变，至于密码子简并突变以及相似氨基酸间的突变要考虑是否影响所研究蛋白的表达、结构、功能。

不符合要求的测序文件需要重克隆或对其进行修补。