姜旭;戚扬;于子瑶;闫婧;刘佳;张聪;赵佳琪;赵臣
【摘 要】目的 提取9种常见蔬菜中的凝集素,对其凝集红细胞效应进行研究,并分析温度和pH对其生物活性的影响.方法 以新鲜蔬菜为材料,经硫酸铵沉淀、透析,得到蛋白质提取液,用人的A型、B型和O型血细胞检测凝集活性.通过耐热、耐酸碱实验比较9种不同蔬菜的红细胞凝集素的生物活性.结果 除大白菜外其余蔬菜均可凝集人类红细胞,且对不同血型红细胞的凝集活性各不相同;其中,豆角和土豆对人类红细胞的凝集强度最强,且对A、B和O型红细胞都有较强的凝集作用;植物凝集素活性对温度敏感,随温度升高,凝集活性明显降低;此外,不同种类植物凝集素对酸碱耐受程度不同,碱性更适合凝集素的保存.结论 蔬菜“血型”并不同于人类红细胞血型,可将植物凝集素的特性用于医学研究领域. 【期刊名称】《重庆医学》 【年(卷),期】2016(045)025 【总页数】3页(P3466-3468) 【关键词】蔬菜;血型抗原;凝集素
【作 者】姜旭;戚扬;于子瑶;闫婧;刘佳;张聪;赵佳琪;赵臣
【作者单位】吉林医药学院2011级临床输血本科班,吉林吉林132013;吉林医药学院2011级临床输血本科班,吉林吉林132013;吉林医药学院2011级临床输血本科班,吉林吉林132013;吉林医药学院2011级临床输血本科班,吉林吉林132013;吉林医药学院2011级临床输血本科班,吉林吉林132013;吉林医药学院2011级临
床输血本科班,吉林吉林132013;吉林医学院2014级检验技术本科班,吉林吉林132013;吉林医药学院检验学院血液检验教研室,吉林吉林132013 【正文语种】中 文 【中图分类】Q945 论著·基础研究
众所周知，人类红细胞血型抗体可引起红细胞凝集[1]，比如A型血人的血浆可以使B型红细胞发生凝集，因为A型血人的血浆里含有抗-B抗体，这种抗体可以特异性的与B型红细胞表面抗原结合，将多个红细胞聚集在一起，从而引起红细胞凝集；同理，B型血人的血浆可以使A型红细胞发生凝集，O型血人的血浆可以使AB型红细胞发生凝集，而O型血人的红细胞不发生凝集，这是人类A、B、O血型的遗传特点。但是研究发现，每天吃的蔬菜、水果也可以引起红细胞的凝集，与血型抗体引起的红细胞凝集非常相似，说明在部分植物体内也存在着能凝集红细胞的物质。日本法医山本茂对150种蔬菜和500多种水果进行化验，发现其中有79种植物具有“血型”反应。例如桃树叶为A型，枝状水藻等为B型，苹果、草莓和西瓜等为O型，李子、桃子和荞麦等为A、B型。本研究以日常生活中常见的蔬菜为材料，对其进行初步研究。
1.1 材料 黄豆、西红柿、葱、土豆、小白菜、大白菜、豆角、香菇、茄子9种新鲜蔬菜均购自农贸市场；2%人标准红细胞悬液(A型、B型、O型)由吉林医药学院血液检验教研室提供；硫酸铵，聚乙二醇20000，碳酸氢钠，氯化钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，柠檬酸，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，氢氧化钠，甘氨酸，EDTA为国产分析纯试剂，由吉林医药学院血液检验教研室提供。 1.2 方法
1.2.1 蔬菜凝集素的分离和提取 蔬菜洗净、晾干(土豆去皮，豆角去皮取豆角豆)，
各取50 g剪碎，按1∶2加入0.9%生理盐水，用组织捣碎机捣碎匀浆，4 ℃ 4 000 r/min离心40 min取上清液，加入硫酸铵达到60%饱和度，4 ℃过夜。4 ℃ 4 000 r/min离心50 min后收集沉淀，用磷酸盐缓冲液(PBS)pH 7.4溶解，4 000 r/min离心10 min除去不溶物，取上清液在PBS中透析过夜，转入蒸馏水中透析3 h，再置于聚乙二醇20000中吸水浓缩，得到粗品溶液，用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，用PBS调整浓度至10 mg/mL，置于4 ℃备用[2]。 1.2.2 血细胞凝集活力试验 在96孔板中加入30 μL PBS，在第1孔中加入凝集素样品30 μL，混匀后取30 μL加入第2孔进行倍比稀释。每孔加入15 μL 2%人标准红细胞悬液(A型、B型、O型)，混匀静置5 min后观察凝集强度，肉眼观察与显微镜观察相结合判断结果。以样品稀释度最高且有显著凝集现象的稀释倍数判定为凝集效价，记录2n。
1.2.3 凝集素热稳定性检测 在96孔板中加入30 μL PBS，取凝集素样品30 μL进行倍比稀释后，置于4 ℃、20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃水浴中保温5 min后取出，待其冷却至室温，加入15 μL 2%人标准红细胞悬液(O型)，混匀静置10 min后，镜检观察凝集强度。以样品稀释度最高且有显著凝集现象的稀释倍数判定为凝集效价，记录2n。
1.2.4 凝集素耐酸、碱能力检测 在96孔板中分别加入30 μL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 5.0～6.0)或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 8.5～9.0)，取凝集素样品30 μL进行倍比稀释后，加入15 μL 2%人标准红细胞悬液(O型)，混匀静置10 min后，镜检观察凝集强度。以样品稀释度最高且有显著凝集现象的稀释倍数判定为凝集效价，记录2n。
2.1 不同蔬菜中植物凝集素活力检测 除大白菜外其他蔬菜对人红细胞均产生凝集现象。黄豆、土豆、豆角、豆角豆、西红柿、小白菜和葱对A型、B型和O型3种红细胞均产生凝集现象；以黄豆、土豆、豆角和西红柿的凝集强度最强，而小
白菜和葱凝集活性较低；此外，香菇对B型和O型红细胞有弱凝集现象，对A型血细胞无凝集；茄子对O型红细胞有弱凝集现象，对A型和B型血细胞均无凝集。见图1、表1。
2.2 植物凝集素的热稳定性分析 黄豆、土豆、西红柿、豆角中凝集素热稳定性较好，在80 ℃高温仍有凝集活性；而葱、小白菜、香菇、茄子在40 ℃即失去凝集活性，显示其热稳定性较差。见表2。
2.3 凝集素耐酸、碱能力分析 黄豆、土豆、西红柿和豆角、豆角豆中植物凝集素在pH为5.0～6.0和8.5～9.0的酸、碱环境中均保持较强凝集活性，具有较强的耐酸、碱能力；葱在pH为5.0～6.0的酸性环境中仍有凝集活性，但是在碱性环境下凝集活性消失；小白菜、香菇和茄子在酸、碱环境下凝集活性均完全消失，表明其耐酸、碱能力较差。见表3。
本研究中除大白菜外其余蔬菜都可以凝集红细胞，黄豆、西红柿、葱、土豆、小白菜、豆角和豆角豆均可凝集A型、B型和O型红细胞，香菇能凝集B型和O型红细胞，茄子可以凝集O型红细胞，那是不是说明上述蔬菜就分别相当于人类的A型、B型或者O型血呢？很显然不是，上述几种蔬菜凝集红细胞的特征不同于人类A、B、O血型的抗原抗体凝集的规律性，因而不能说某种蔬菜是A型血或者B型血。植物之所以能凝集红细胞是因为其体内存在着能与红细胞表面糖链结合的蛋白成分，称为植物凝集素[3]，与人类血型抗体功能类似，但并非同一种物质，也不具有人类血型遗传的规律性。
植物凝集素是来源于植物的一类能凝集细胞和沉淀单糖或多糖复合物的非免疫来源的非酶蛋白质[4]。一个凝集素分子通常具有两个以上的糖结合位点，因而能同时与多个细胞结合，使游离的单细胞聚集成团，起到类似于红细胞血型抗体的作用。植物凝集素是一种天然的生物活性物质，不但能凝集红细胞，还可凝集其他细胞，如精子、淋巴细胞、细菌等[5]，是分离纯化和研究糖复合物结构与功能的重要的
工具，是阐明糖和蛋白质相互作用机制的理想模型。在免疫学上，植物凝集素是促淋巴细胞有丝分裂剂；在神经学科上，可用于研究神经元表面结构，外周神经元损伤带来的后果及其修复机制，细胞神经递质受体等[6]；在生殖医学上，植物凝集素可通过降低精子生存期或导致精子完全制动并发生不可逆致死来达到避孕和抗早孕的目的[7]，还可通过引起胎盘组织组织坏死、细胞凋亡或副凋亡途径达到终止小鼠中晚期妊娠[8]。
植物凝集素还可用于构成免疫毒素和作为有效的免疫佐剂及靶向性运载工具等[9]。此外，有报道称植物凝集素对小鼠骨髓细胞微核发生率有一定影响[10-11]。 本研究通过对蔬菜的凝集素的研究发现，不同蔬菜中植物凝集素的水平不同，不同蔬菜的凝集素活力也不同。黄豆、西红柿、土豆和豆角的凝集强度最强，茄子、小白菜和葱的凝集活性最弱，大白菜则没有凝集红细胞的活力。本研究中，香菇对A型血细胞无凝集，茄子对A型、B型血细胞均无凝；豆角豆对O型红细胞凝集强度最强，对A型和B型红细胞的凝集强度较弱，而完整的豆角对A型、B型和O型红细胞都有较强的凝集现象，证明豆荚和豆中都有凝集素，且豆荚的凝集素活力比豆角豆的凝集活力强。在热稳定性方面，黄豆、土豆、西红柿和豆角在80 ℃高温仍有凝集活性，表明其植物凝集素的热稳定性较好，而葱、小白菜、香菇、茄子在40 ℃即失去凝集活性，显示其热稳定性较差。此外，西红柿、葱、土豆在酸、碱性环境下凝集活性无变化。豆角在酸性环境下变化较大，在碱性环境无变化，香菇在酸、碱性环境下凝集活性消失，黄豆在酸、碱性环境下凝集活性减弱。 有研究表明，有些凝集素对红细胞的凝集作用具有种属专一性，有的则没有种属专一性[6]。例如，狗脊蕨凝集素对人的A型、B型和O型血细胞的凝集活性相差不大，对其他种属来源的红细胞凝集活性有较大的差异，而红花菜豆凝集素对多种动物的红细胞具有凝集作用。在本研究中，不同蔬菜对A型、B型和O型红细胞表现出不同的凝集效应，黄豆对A型和O型红细胞凝集活力更强，香菇对B型和O
型血细胞具有凝集效应，茄子只表现出对O型血细胞的凝集效应，而西红柿、葱、土豆、小白菜和豆角对3种红细胞凝集活力基本相同。上述结果表明，不同的植物凝集素凝集红细胞效应是基于其对红细胞表面不同糖链的结合，不同蔬菜之间具有不同的种属特异性，由于不同的凝集素的糖结合特异性不会因环境而异，因此其对于不同细胞的凝集能力的不同能表明不同细胞表面糖受体组成的差异，这与人类A、B、O血型抗体结合红细胞表面的A抗原或B抗原而产生的红细胞凝集效应类似，但并不同于人类血型抗体。
总之，凝集素虽能凝集人红细胞，但并不同于人类红细胞血型抗体。不同种类植物凝集素凝集红细胞的活力不同，糖结合位点也不同，对温度、酸碱度等变化的耐受程度也不同。明确其生物活性特质对研究其生物学功能及开发其医用、药用价值具有重要作用。
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