(12)发明专利说明书
(21)申请号 CN201110361186.X (22)申请日 2011.11.15
(71)申请人 无锡贝迪生物工程有限公司
地址 214063 江苏省无锡市滨湖区马山生物医药工业园(紫云路) (72)发明人 任伟业
(74)专利代理机构 北京同恒源知识产权代理有限公司 代理人 张水俤 (51)Int.CI
C12P21/02 C07K14/78 C07K1/36
(10)申请公布号 CN 102363798 A (43)申请公布日 2012.02.29
权利要求说明书 说明书 幅图
(54)发明名称
胶原蛋白海绵的制备工艺
(57)摘要
本发明涉及一种胶原蛋白海绵的制
备方法，以新鲜猪皮为原料，经预处理，去除脂肪，经酸酶法处理后，使用超声波处理，进一步提高提取效率，最后纯化制得高纯度的胶原产品，再通过酶法交联和冷冻干燥制得胶原蛋白海绵。本发明胶原
蛋白海绵的制备方法提取效率高，产品纯度达到98％以上。该产品包含保持三螺旋结构的活性胶原冷冻干燥制成胶原蛋白海绵，具有低免疫原性、高生物相容性，可生物降解，适用于医疗用途。 法律状态
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.一种胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：原料预处
理、除脂、酸酶结合处理、超声波处理、H2O2溶
纯化、酶法交联、干燥。
液处理、酸溶盐析纯化、透析
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的原料为选自新鲜
猪皮、牛皮、牛跟腱中的一种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的酸酶结合处理为：
经过预处理的原料浸入0.6～0.7mol/L冰醋酸和600～700mg/L胃蛋白酶的
中，持续搅拌25～30小时左右。
混合液
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的超声波处理优选
采用渐进式超声波处理，先使用100～200W超声处理30分钟，再使用
超声处理30分钟，最后使用300～400W超声处理1小
200～300W 时。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)取新鲜猪皮，切割清除油脂层和毛皮层，去除杂质，清洗，将猪皮破
碎成小颗粒状，按照固液比1∶30～1∶40的比例，加入0.01～0.03mol/L的
水溶液，于6～8℃浸泡1～2小时，过滤，备用。
氢氧化钠
(2)在上述预处理后的猪皮中加入质量为猪皮质量6～8倍的无水乙醚或者
丙酮，于35～40℃回流5-8小时，之后用蒸馏水冲洗至无异味，备用。
(3)将上述猪皮浸入0.6～0.7mol/L冰醋酸和600～700mg/L胃蛋白酶的混合
(4)对上述混合物采用渐进式超声波处理，先使用100～200W超声处理
液中，持续搅拌25～30小时左右。
30分钟，再使用200～300W超声处理30分钟，最后使用300～400W超声
小时。
处理1
(5)加入2～3％的H2O2溶液，混合静置2～4小时，调节pH至5.0，离心。
(6)取上清液，加入NaCl，搅拌20-30小时，离心，沉淀物加入0.6-0.7moL/L
冰醋酸溶解，离心，取上清液，调节pH至7.5，加入NaCl，搅拌
离心。
20-30小时，
(7)将步骤(6)得到的沉淀物溶解于0.6～0.7moL/L冰醋酸，先以
0.6～0.7moL/L的冰醋酸为透析外液透析2次，每次4小时，再以蒸馏水为
外液透析5～7次，每次4小时，至外液检测不到氯离子，得
透析
到胶原液体。
(8)按40-60U/g胶原的比例加入谷氨酰胺转氨酶，交联2-5小时；
(9)冷冻干燥，得到胶原蛋白海绵。
说 明 书
技术领域
本发明涉及一种胶原蛋白海绵的制备方法，属于蛋白质工程领域，该产品 背景技术
胶原是脊椎动物体内含量最丰富、分布最广泛的一组硬蛋白，分子量约为 肤
300000，均可在细胞外形成超分子聚集物，大量存在于骨、软骨、肌腱及皮
中，占人体或其他动物体总蛋白含量的25％-33％。同一组织中常含
的胶原，常以某种为主。I型胶原遍布于肌体的各部分，主要
韧带中，具有很强的抗张能力。II型胶原主要存在于透
有较强的抗压能力。III型胶原广泛分布于伸展
等，具有伸展性及应变性。其中，I型胶
I型胶原在生物材料中的使用也最
由保持三螺旋结构的活性胶原经交联制得，具有低免疫原性、高生物相容性，
可生物降解，适用于医疗用途。
有几种类型 为皮肤、肌腱及
明软骨、玻璃体中，具
性大的组织中，如疏松结缔组织 原占生物体总胶原量的90％，因此， 广泛。
胶原在分子水平结构相同，由3条a链多肽组成，每一条胶原链都是左手 原
螺旋构型。3条左手螺旋链又相互缠绕成右手螺旋结构，即超螺旋结构为胶
蛋白独特的三重螺旋结构，使其分子结构非常稳定。3条链富含甘氨
酸和丙氨酸，缺乏半胱氨酸和色氨酸，酪氨酸含量也很低，但
基酸(羟脯氨酸和羟赖氨酸)。由于原纤维的方向性和成
同组织的胶原存在结构差异，并具有各自的功能
胶原除了机械支撑外，还是细胞粘附和移
为是胚胎发育和组织再生中重要的
酸、脯氨
含独特的羟化氨
束直径及密度的不同，不 和结构特征。在结缔组织中，
动的重要物质基础，因此，胶原被认
形态发生因素，在组织工程中得到广泛应用。
胶原蛋白海绵主要成分是胶原蛋白，它与人体胶原蛋白结构相似很适合人
体器官的修复和再生。胶原蛋白能促进伤口愈合和肉芽
的止血和填充作用，可用于促进创面愈合、止血、
孔支架的过程中应考虑支架材料以及支架
个可以促进细胞粘附和生长的具有
相容性，且能够保持一定的
胞在孔间进行迁移的
一种优质的医
组织的生长，具有良好
手术残腔填充等。在制备多
的三维结构对细胞活性的影响。对一
生物活性的支架来说，必须具有良好的生物
体内降解速率。支架应具有适当的平均孔径，使细
同时保持恰当的细胞粘附面积，胶原蛋白海绵被公认为是 用材料。
CN101005865A中公开了一种胶原蛋白海绵的制备方法，以戊二醛进行交 术
联，其胶原提取效率和纯度都较低，交联剂使用戊二醛安全性较低。现有技
公开的方法在胶原的提取制备过程中往往破坏胶原的三螺旋结构，或
率较低，无法实现既能够保留活性胶原的三螺旋结构，又同时
纯度，并以此胶原经酶法交联制备安全的胶原蛋白海绵。
者提取效
提高提取效率和 发明内容
针对上述情况，本发明的目的是提供一种胶原蛋白海绵的制备方法。本发 三
明使用酸酶结合处理加渐进式超声波处理的制备方法，不仅能够保持胶原的
螺旋结构，同时显著的提高了胶原的提取效率，并经过酶法交联，制
白海绵。本发明使用H2O2溶液处理
原产品的纯度，保证了胶原
备胶原蛋
加酸溶盐析纯化加透析纯化有效的提高了胶 蛋白海绵良好的生物相容性。
一种胶原蛋白海绵的制备方法，包括如下步骤：原料预处理、除脂、酸酶
结合处理、超声波处理、H2O2溶液处理、酸溶盐
干燥。
析纯化、透析纯化、酶法交联、
所述的原料为选自新鲜猪皮、牛皮、牛跟腱中的一种。
所述的酸酶结合处理为：经过预处理的原料浸入0.6～0.7mol/L冰醋酸和
所述的超声波处理优选采用渐进式超声波处理，先使用100～200W超声处
理30分钟，再使用200～300W超声处理30分钟，最
理1小时。
600～700mg/L胃蛋白酶的混合液中，持续搅拌25～30小时左右。
后使用300～400W超声处
所述的胶原蛋白海绵的制备方法，具体步骤如下：
(1)取新鲜猪皮，切割清除油脂层和毛皮层，去除杂质，清洗，将猪皮破
碎成小颗粒状，按照固液比1∶30～1∶40的比例，加入0.01～0.03mol/L的
水溶液，于6～8℃浸泡1～2小时，过滤，备用；
氢氧化钠
(2)在上述预处理后的猪皮中加入质量为猪皮质量6～8倍的无水乙醚或者
(3)将上述猪皮浸入0.6～0.7mol/L冰醋酸和600～700mg/L胃蛋白酶的混合
(4)对上述混合物采用渐进式超声波处理，先使用100～200W超声处理
30分钟，再使用200～300W超声处理30分钟，最后使用300～400W超声
小时；
液中，持续搅拌25～30小时左右；
丙酮，于35～40℃回流5-8小时，之后用蒸馏水冲洗至无异味，备用；
处理1
(5)加入2～3％的H2O2溶液，混合静置2～4小时，调节pH至5.0，离心；
(6)取上清液，加入NaCl，搅拌20-30小时，离心，沉淀物加入0.6-0.7moL/L
冰醋酸溶解，离心，取上清液，调节pH至7.5，加入NaCl，搅拌20-30小
离心；
时，
(7)将步骤(6)得到的沉淀物溶解于0.6～0.7moL/L冰醋酸，先以 0.6～
0.7moL/L的冰醋酸为透析外液透析2次，每次4小时，再以蒸馏水为透析
(8)按40-60U/g胶原的比例加入谷氨酰胺转氨酶，交联2-5小时；
(9)冷冻干燥，得到胶原蛋白海绵。
酸酶结合处理：本发明所述的酸酶结合处理是指经过预处理的原料浸入
0.6～0.7mol/L冰醋酸和600～700mg/L胃蛋白酶的混合液中，持续搅拌
时左右。该方法结合了酸法和酶法提取制备胶原的特点，防止
螺旋结构的破坏，有效的提高了提取效率。
外液透析5～7次，每次4小时，至外液检测不到氯离子，得到胶原液体；
25～30小
了对活性胶原三
超声波处理：本发明所述的酸酶结合处理是指采用渐进式超声波处理，先
使用100～200W超声处理30分钟，再使用200～
使用300～400W超声处理1小时。本发
胶原蛋白，经过实验研究发现，采
用渐进式超声波处理与采用
螺旋结构的破坏，并
300W超声处理30分钟，最后
明采用超声波处理结合酸酶法提取制备 用超声波处理能够有效的提高提取效率。采
固定功率超声处理相比，能够更好的防止胶原的三 且有效的降低超声波处理阶段的生产能耗。
本发明的有益效果：本发明使用酸酶结合处理加渐进式超声波处理的制备 同
方法，最大程度上减少了对胶原结构的破坏，保持活性胶原的三螺旋结构，
时显著的提高了胶原的提取效率，降低了生产成本。同时，渐进式超
也在超声波处理环节一定程度上降低了能耗。本发明使用
盐析纯化加透析纯化有效的
的安全性。本发明的
容性，已经通
代用品、
声波处理
H2O2溶液处理加酸溶 提高了胶原产品的纯度。使用酶法交联提高了产品
方法制得的胶原蛋白海绵产品具有低免疫原性和高生物相
过工业化生产，并广泛应用于医疗产品，如：皮肤代用品、骨骼 胶原蛋白敷料、生物工程膜等。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明： 实施例1
(1)取新鲜牛皮，切割清除油脂层和毛皮层，去除杂质，清洗，将牛皮破
碎成小颗粒状，按照固液比1∶30的比例，加入0.03mol/L的氢氧化钠水溶
于6～8℃浸泡2小时，过滤，备用；
液，
(2)在上述预处理后的牛皮中加入质量为牛皮质量8倍的无水乙醚或者丙
(3)将上述牛皮浸入0.6mol/L冰醋酸和700mg/L胃蛋白酶的混合液中，
(4)对上述混合物采用渐进式超声波处理，先使用100W超声处理30分
持续搅拌25小时左右；
酮，于35℃回流8小时，之后用蒸馏水冲洗至无异味，备用；
钟，再使用300W超声处理30分钟，最后使用400W超声处理1小时；
(5)加入2％的H2O2溶液，混合静置4小时，调节pH至5.0，离心；
(6)取上清液，加入NaCl，搅拌20小时，离心，沉淀物加入0.7moL/L 离
(7)将步骤(6)得到的沉淀物溶解于0.7moL/L冰醋酸，先以0.7moL/L 酸为透析外液透析2次，每次4小时，再以蒸馏水为透析外液透析5次，
(8)按40U/g胶原的比例加入谷氨酰胺转氨酶，交联5小时；
(9)冷冻干燥，得到胶原蛋白海绵。 实施例2
(1)取新鲜牛跟腱，切割清除油脂层和毛皮层，去除杂质，清洗，将牛跟
腱破碎成小颗粒状，按照固液比1∶40的比例，加入0.01mol/L的氢氧化钠
液，于6～8℃浸泡1小时，过滤，备用；
每次4小时，至外液检测不到氯离子，得到胶原液体；
的冰醋
冰醋酸溶解，离心，取上清液，调节pH至7.5，加入NaCl，搅拌20小时，
心；
水溶
(2)在上述预处理后的牛跟腱中加入质量为牛跟腱质量6倍的无水乙醚或
(3)将上述牛跟腱浸入0.7mol/L冰醋酸和600mg/L胃蛋白酶的混合液中，
持续搅拌30小时左右；
者丙酮，于40℃回流5小时，之后用蒸馏水冲洗至无异味，备用；
(4)对上述混合物采用渐进式超声波处理，先使用100W超声处理30分
(5)加入3％的H2O2溶液，混合静置2小时，调节pH至5.0，离心；
(6)取上清液，加入NaCl，搅拌30小时，离心，沉淀物加入0.6moL/L 离
(7)将步骤(6)得到的沉淀物溶解于0.6moL/L冰醋酸，先以0.6moL/L 酸为透析外液透析2次，每次4小时，再以蒸馏水为透析外液透析7次，
(8)按60U/g胶原的比例加入谷氨酰胺转氨酶，交联2小时；
(9)将上述液体冷冻干燥，得到胶原蛋白海绵。 实施例3
(1)取新鲜猪皮，切割清除油脂层和毛皮层，去除杂质，清洗，将猪皮破
碎成小颗粒状，按照固液比1∶35的比例，加入0.02mol/L的氢氧化钠水溶
于6～8℃浸泡1.5小时，过滤，备用；
每次4小时，至外液检测不到氯离子，得到胶原液体；
的冰醋
冰醋酸溶解，离心，取上清液，调节pH至7.5，加入NaCl，搅拌30小时，
心；
钟，再使用200W超声处理30分钟，最后使用300W超声处理1小时；
液，
(2)在上述预处理后的猪皮中加入质量为猪皮质量7倍的无水乙醚或者丙
酮，于37℃回流6小时，之后用蒸馏水冲洗至无异味，备用；
(3)将上述猪皮浸入0.65mol/L冰醋酸和650mg/L胃蛋白酶的混合液中，
(4)对上述混合物采用渐进式超声波处理，先使用150W超声处理30分
(5)加入2.5％的H2O2溶液，混合静置3小时，调节pH至5.0，离心；
(6)取上清液，加入NaCl，搅拌25小时，离心，沉淀物加入0.65moL/L 离
(7)将步骤(6)得到的沉淀物溶解于0.65moL/L冰醋酸，先以0.65moL/L
的冰醋酸为透析外液透析2次，每次4小时，再以蒸馏水为透析外液透析6
每次4小时，至外液检测不到氯离子，得到胶原液体；
冰醋酸溶解，离心，取上清液，调节pH至7.5，加入NaCl，搅拌25小时，
心；
钟，再使用250W超声处理30分钟，最后使用350W超声处理1小时；
持续搅拌28小时左右；
次，
(8)按50U/g胶原的比例加入谷氨酰胺转氨酶，交联4小时；
(9)冷冻干燥，得到胶原蛋白海绵。
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