1768动物营养学报2013，25（8）：1762-
doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2013.08.013
不同氨基酸模式对奶牛乳腺上皮细胞
酪蛋白合成的影响
张兴夫 杜瑞平 敖长金
1
2
1*
（1.
内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特010018；2.内蒙古农牧业科学院动物营养研究所，呼和浩特010031）
高 民
2*
卢德勋
2
摘 要：本试验旨在验证氨基酸模式的不同是否会影响奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白的合成。采
BP）、全乳用完全随机试验设计设置4个组，分别为低蛋白质饲粮条件下血液氨基酸模式组（LP
）、80%酪蛋白+20%乳清蛋白氨基酸模式组（CLP）、酪蛋白氨基酸模式蛋白氨基酸模式组（MP
），每组3个重复，并重复试验3次。分别用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和酶联免疫吸组（CPSA）检测乳蛋白合成基因α-酪蛋白（CSN1S1）和κ-酪蛋白（CSN3）mRNA表达量附法（ELI
及α-酪蛋白合成量。结果表明：氨基酸模式能够显著影响CSN1S1和CSN3基因mRNA表达
05）。MP组CSN1S1和CSN3基因mRNA表达量分别显著和极显著高于LPBP组量（P＜0.
（P＜0.05和P＜0.01）；相对于LPBP组，MP组CSN1S1和CSN3基因mRNA表达量分别上调70和2.12倍。MP组α-酪蛋白合成量显著高于CLP、CP组（P＜0.05），极显著高于了1.LPBP组（P＜0.01）。由此可见，氨基酸模式的不同能够影响奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白的合成，全乳蛋白氨基酸模式可能是一种较为理想的氨基酸模式。关键词：乳腺上皮细胞；氨基酸模式；基因表达；酪蛋白
823 文献标识码：A 文章编号：1006-267X（2013）08-1762-07中图分类号：S
s1
s
s
乳蛋白是构成牛奶品质的重要基础，氨基酸
作为重要的前体物质对乳蛋白的合成具有调控作用。近年来，理想氨基酸平衡模式已在猪禽饲粮配方中得到广泛的应用，但是由于反刍动物自身的消化特点，针对于反刍动物理想氨基酸模式的研究还有待深入。有研究证实，饲粮中氨基酸组成能够影响泌乳反刍动物乳腺合成乳蛋白的能力，因此可以推测，或许存在着一种能够使奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成能力达到最优的氨基酸模式。在国际上，研究者大多通过添加过瘤胃保护氨基酸，或者真胃灌注不同组成模式的氨基酸，研究其对乳蛋白合成的影响；在国内，研究者以奶山羊为试验模型，采用阴外动脉灌注技术研究氨基酸平衡对乳蛋白含量的影响。但是
[1-3]
[4-5]
[6]
[7-10]
[11]
目前以奶牛乳腺上皮细胞为试验对象，在转录水平和蛋白质合成水平上针对不同氨基酸模式对乳蛋白合成影响的研究还未见报道。本试验在建立奶牛乳腺上皮细胞培养法的基础上，分别用实时
CR（RT-qPCR）和酶联免疫吸附法荧光定量P
（ELISA）检测乳蛋白合成基因α-酪蛋白（CSN1S1）和κ-酪蛋白（CSN3）mRNA表达量及α-酪蛋白合成量，验证氨基酸模式的不同是否会影响乳腺上皮细胞酪蛋白的合成，并初步提出能够促进酪蛋白合成的较为理想的氨基酸模式。
s1
s
1
1.1
试验设计
试验采用完全随机试验设计设置4个组，分
材料与方法
收稿日期：2012-02-18
基金项目：国家“973”计划项目（2011CB100803）
mail：zhangxingfu666@sina.com作者简介：张兴夫（1985—），男，内蒙古呼伦贝尔人，博士研究生，研究方向为动物营养与畜产品品质。E--mail：changjinao@yahoo.com.cn；高 民，研究员，硕士生导师，E-mail：gmyh1588@yahoo.*通讯作者：敖长金，教授，博士生导师，E
com.cn
8
期
[12]
张兴夫等：不同氨基酸模式对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白合成的影响
[13]
1763
别为低蛋白质饲粮条件下血液氨基酸模式组（LPBP）、全乳蛋白氨基酸模式组（MP）、80%酪蛋白+20%乳清蛋白氨基酸模式组（CLP）、酪蛋白氨基酸模式组（CP），每个组3个重复，并重复试验3次。4种氨基酸模式组的
[14]
[14]氨基酸配比见表1。试验开始前，分别配制4种氨
F12培基酸模式的培养基，配制方法参考DMEM/
养基配方，各培养基中总氨基酸浓度均为1070mg/L，配制完成后调整培养基pH在7.0～7.4之间。
%
表1 不同氨基酸模式组的氨基酸配比
Table1 Percentageofaminoacidsingroupsofdifferentaminoacidpatterns
氨基酸Aminoacids-Tyr酪氨酸L
L--Ala丙氨酸L
L--Gly甘氨酸L
L--Glu谷氨酸L
L--Ser丝氨酸L
L--Cys半胱氨酸L
L--Phe苯丙氨酸L
L--Leu亮氨酸L
L--lle异亮氨酸L
L--His组氨酸L
L--Lys赖氨酸L
L--Thr苏氨酸L
L--Met蛋氨酸L
L--Try色氨酸L
L--Val缬氨酸LL-2.1811.6629.7710.508.314.152.295.753.941.282.726.760.801.658.25
oupsofdifferentaminoacidpatterns不同氨基酸模式组GrLPBP
MP5.673.782.2729.306.050.766.0510.975.303.7810.215.672.271.896.05
CLP6.302.910.4025.005.931.166.5418.526.172.327.465.603.651.806.22
CP6.632.770.4826.406.030.486.6317.376.272.417.245.553.741.576.39
乳腺上皮细胞培养
乳腺上皮细胞培养方法参照Miranda等略有修改。选取泌乳中期的健康中国荷斯坦奶牛，采集乳腺深层组织（注意避开结缔组织和脂肪组
bco，美国）的DMEM/织）适量，放入含有双抗（Gi
F12培养基中，置于保温盒中迅速带回实验室。在超净台中用含有3倍双抗的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS，Hyclone，美国）冲洗乳腺组织块3遍，再
，再用含有1倍放入75%的乙醇溶液中浸泡30s
BS冲洗至清澈。在培养皿中使用眼科双抗的DP
剪刀和镊子精细选取腺泡组织，放入5mL细胞冻存管中，再次使用眼科剪刀将其剪碎，放入等体积0.05%Ⅱ型胶原酶（Gibco，美国）溶液，放置于37℃、5%CO培养箱消化90min，期间每隔20min震荡1次。取出已消化完成的溶液，使用80目网筛过滤，将滤液移入15mL离心管中，以1500r/min离心3min，弃去上清液，加入培养基
m细胞培养瓶中，放入后重新悬浮，接种于25c
1.2
[15]
2
2培养箱内培养。待细胞铺满瓶底
后，进行传代与纯化。选取纯化后的第3代形态稳定的乳腺上皮细胞用胰蛋白酶消化后以3×10个/mL的密度接种于6孔板上，待细胞铺满以后再做处理。在正式试验前，将细胞置于无血清的培养基中空白处理24h，以消除血清中未知因子对试验处理的影响，之后再换成不同氨基酸模式的培养基处理48h。1.3 RT-qPCR检测CSN1S1、CSN3基因mRNA表达量
处理后的乳腺上皮细胞用TIANGEN总RNA
430）提取细胞总RNA后立即用提取试剂盒（DP
TaKaRaD-反转录试剂盒（DRR036A）反转录成cNA，然后使用实时定量PCR仪（Bio-Rad，美国），选用磷酸甘油脱氢酶（GAPDH）为内参基因，应用TaKaRaSYBRPremixExTaqⅡ（DRR081）试剂盒进行CSN1S1、CSN3基因mRNA表达量的定量
qPCR引物信息及反应条件见表2。分析。RT-37℃、5%CO2
5
TM
1764
动 物 营 养 学 报
qPCR引物信息及反应条件表2 RT-Table2 PrimerinformationandreactionconditionforRT-qPCRPrimersequences（5′—3′）
25
卷
基因Genesαs1-CSN1S1κ-CSN3
引物序列GenBank
GenBankaccessionNo.Productsize/bp
BC109618NM 174294XM 001252479
189148177
登录号产物大小退火温度Tm/℃595659
酪蛋白酪蛋白
磷酸甘油醛脱氢酶
GAPDH
上游：AATCCATGCCCAACAGAAAG
下游：TCAGAGCCAATGGGATTAGG上游：CCAGGAGCAAAACCAAGAAC下游：TGCAACTGGTTTCTGTTGGT上游：GGGTCATCATCTCTGCACCT下游：GGTCATAAGTCCCTCCACGA
s
CSN1S1基因mRNA表达量显著高于其他各组检测α-酪蛋白合成量
处理后的乳腺上皮细胞应用天净沙细胞裂解（P＜0.05），其他各组间差异不显著（P＞0.05）。液（80807B-50）进行处理。首先去除细胞培养CSN3基因mRNA表达量也有相同的结果，MP组
BS洗2遍，将6孔板放置在冰上，CSN3基因mRNA表达量极显著高于LPBP组基，用预冷的DP
n（P＜0.01），CLP和CP组显著高于LPBP组（P＜每孔加入100μL细胞裂解液，冰上放置15mi
05）。后，将细胞培养板倾斜使上清液汇集在一起，并将0.
5mL塑料离心管中，以其全部转移到1个新的1.
15000×g于4℃离心10min，将上清液转移到1
5mL离心管中，放置冰上待用。采用个新的1.
R&DSA检测试剂盒测公司的牛α-酪蛋白ELI
定各个组的α-酪蛋白合成量。此试剂盒检测原
SA，往预先包被α-理是采用双抗一步夹心ELI
酪蛋白抗体的包被孔中一次加入标本、标准品、辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物3，3，5，5-四甲基联苯胺（TMB）显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成
蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色 数据柱标注相邻字母表示差异显著（P＜0.05），相间的深浅和样品中的α-酪蛋白合成量呈正相关。字母表示差异极显著（P＜0.01），相同或者无字母表示差用酶标仪在450nm波长下测定吸光值（OD），计异不显著（P＞0.05）。下图同。
Datacolumnswithadjacentlettersmeansignificant算样品浓度。线性回归方程为：1.4 ELISA
s
s
s
s
1.5
数据处理
试验原始数据使用Excel2007进行计算和整理，基因表达数据采用2法进行计算，所得整
AS9.0软件的ANOVA过程理后试验数据采用S
an氏进行单因子方差分析，多重比较采用Dunc
05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。法，P＜0.
-t△△C
2y=0.002x+0.0632（R=0.996）。
difference（P＜0.05），andwithalternatelettersmeanex-tremelysignificantdifference（P＜0.01），whilewiththesameornolettersmeannosignificantdifference（P＞0.05）.Thesameasbelow.
图1 不同氨基酸模式对奶牛乳腺上皮细胞
CSN1S1和CSN3基因mRNA
表达量的影响
Fig.1 Effectsofdifferentaminoacidpatternson
mRNAexpressionlevelsofCSN1S1andCSN3genesinmammaryepithelial
cellsofdairycows
2
2.1
N1S1、CSN3基因mRNA表达量的影响对CS
由图1可知，不同氨基酸模式对CSN1S1基因mRNA表达量有显著影响（P＜0.05），MP组
结果与分析
8
期
张兴夫等：不同氨基酸模式对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白合成的影响
1765
2.2
合成量有显著影响由图对αs
-酪蛋白合成量的影响
2可知，不同氨基酸模式对αs
-酪蛋白
（P＜0.
05），MP组极显著高于LPBP组（P＜0.01），CLP和CP组也显著高于LPBP组（P＜0.05）。
图2 不同氨基酸模式对奶牛乳腺上皮细胞
αs
-酪蛋白合成量的影响
Fig.2 Effectsofdifferentaminoacidpatternsonαs
-caseinsynthesiscontentinmammaryepithelialcellsof
dairycows
3
讨 论
3.1
奶牛乳腺上皮细胞体外培养
年的历史牛乳腺上皮细胞培养在国际上已经有50多[16]
到目前为止，而我国这方面的研究才刚刚起步。系建立的报道，在我国尚无永生性牛乳腺上皮细胞腺上皮细胞系并不是很多。目前，在国际上已经存在的牛乳
[17]
立了等牛乳腺上皮细胞系。Schmid等首先建
BMGE；随后，Gi
bson[18]
胞系又建立了P
S-BME-L6和PS-BME-L72个细[19]
乳腺上皮细胞。Huynh等用S
V40LT-抗原基因转染牛，使其获得永生性，从而建立了MAC-T细胞系。但是近年来，研究人员发现MA性C-T在体外培养条件下呈现了许多异常的特
身的局限性，因此在功能性乳腺研究方面，MAC-T存在自[20]
法。因而，研究人员通常采用组织块
上皮细胞进行原代培养、酶消化法、乳汁上皮细胞分离法等方法对乳腺是一种特异性的分化细胞，但是由于乳腺上皮细胞和体内环境相一致，体外培养环境又难以去分化，所以造成了乳腺上皮细胞的乳相关基因的表达上，而这种去分化作用尤其表现在细胞内泌培养的时间越长这种去分化作用就越明显。有研究报道，细胞在体外[21]
，这
就使在体外培养条件下检测乳腺上皮细胞泌乳相关基因表达与酪蛋白合成变得十分困难采用酶消化法对奶牛乳腺上皮细胞进行原代培。本试验养现所采集乳腺的鲜活性和细胞传代时的接种密度，并采用差酶消化法对其进行纯化，在研究中发对于泌乳相关基因的表达具有决定性的影响。3.酪蛋白合成的影响
2 不同氨基酸模式对奶牛乳腺上皮细胞 为模型在体外研究氨基酸对乳蛋白合成调节主要目前，国内外研究中使用奶牛乳腺上皮细胞集中在限制性氨基酸及小肽等方面来金良而对理想氨基酸模式的研究较少、功能性氨基酸、支链氨基酸，。
[22]qCR检测赖氨酸（Lys）、蛋氨酸乳腺组织中苏氨酸利用RT-（Met）、（Thr）、苯丙氨酸（Phe）对体外培养
CSN1S1基因表达影响时发现：Lys
、Me量也不同t、Thr、Phe添加水平不同，CSN1S1基因的表达
别为；当培养基中Lys
、Met、Thr、Phe水平分徐柏林197、57[23]
适宜浓度的精氨酸以奶牛乳腺上皮细胞为模型研究发现、121、126mg/
L时，其表达量最高。，
细胞中（Ar
g）能够促进奶牛乳腺上皮白CSN1S1、αs2
-酪蛋白（CSN1S2）、β-酪蛋液中（CSN2）、CSN3基因的表达，的表达显著上调Ar
浓度为且当体外细胞培养
g556mg/L时，这4种酪蛋白基因。李喜艳[24]
研究发现，当Lys和Me时奶牛乳腺上皮细胞中总酪蛋白的合成量最大t以1.
2和0.4mmol/L浓度，即3∶1比例添加并显著地促进了乳蛋白合成相关基因的表达以及，与乳蛋白合成相关路径的基因的表达究结果说明。以上的研促进乳蛋白的合成应有适当的比例与浓度，氨基酸作为乳蛋白合成的前体物对酸的平衡性对于提高乳蛋白含量和合成效率具有
，氨基现实意义[25]
蛋白质。BP组代表的是低血中各氨基酸组成比例（9.
干物质在本试验中，LP
3%）饲粮条件下泌乳奶牛静脉的比例，除Thr外其他必需氨基酸
氨基酸比例过低导致了LP
BP组明显低于其他各组，有可能是必需量与LP
BP组αs-酪蛋白合成其他各组CSN1S1、CSN3基因mRNA表达量显著低于
。在体内试验中，Ba
ch等[26]
蛋白质水平饲喂不同粗酸构成（15%和18%）及不同小肠食糜氨基分别用（与酪蛋白氨基酸构成接近和有较大差异表示，H和L）的4种饲粮，结果表明饲喂H
1766
动 物 营 养 学 报
25
卷
型饲粮的乳腺组织对总氨基酸的吸收速度较快，15%到H型饲粮的乳蛋白合成的氮利用率较高，达分利用合成乳蛋白的氨基酸供给模式33%，这充分说明应存在一个能使乳腺组织充建议把乳蛋白或者是微生物蛋白质氨基酸组成模。有研究者式作为奶牛的理想氨基酸模式酪蛋白氨基酸组成模式作为理想氨基酸模式的参，也有研究者使用照浓度相同的情况下。本试验的研究结果显示，在培养基中氨基酸蛋白氨基酸模式在泌乳相关基因转录及蛋白质合，相对于其他氨基酸模式，全乳成可为反刍动物理想氨基酸模式理论的完善提供一2个层次上均有显著的促进作用，此研究结果些参考。
4
结 论
胞酪蛋白的合成
氨基酸模式的不同能够影响奶牛乳腺上皮细
白氨基酸模式更能促进奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白，相对于其他氨基酸模式，全乳蛋的合成。
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