(完整word版)4细胞工程(安利国)第四章考试重点

第四章 细胞培养

1、培养细胞分为：贴壁型和悬浮型。

2、细胞培养培养基可分为天然培养基和合成培养基。 3、细胞培养包括原代培养和传代培养。

4、原代培养：指细胞或组织离开有机体之后的首次培养。

5、传代培养：培养细胞生长到一定密度后就需要更换新的培养液，这就是细胞的传代培养。 细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代或再培养。 6、细胞培养的基本方法有：悬滴培养法、培养瓶培养法、旋转管培养法。 7、常用培养技术有：二倍体培养、克隆培养、同步化培养、大规模培养。

8、原代培养的细胞一经传代就称之为细胞系，是一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。细胞系经过进一步的克隆化，便得到由单一细胞组成的细胞群体称之为细胞株。

9、动物的细胞与组织培养是从动物体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术。

10、1907年Harrison采用淋巴液做培养基，培养蛙胚神经组织生活了数周，并观察到神经细胞突起的生长过程，创立了在体外观察和研究活组织的方法。1912年Carrel发现鸡胚胎抽取液有促进细胞生长的作用。 11、贴附包括细胞与细胞之间的相互接触和细胞与细胞外基质之间的相互接触两种方式。 12、根据体外培养细胞在支持物上贴附生长时的形态，大致分为如下四种类型： 上皮细胞型、成纤维细胞型、游走细胞型、多形型细胞。

13、培养细胞的生长特点：贴附、接触抑制（由细胞接触而抑制细胞运动的现象，是区别正常细胞与癌细胞标志之一）密度抑制。

14、细胞周期：指一个母细胞分裂结束后形成的细胞至下一次再分裂结束形成两个子细胞的时期，可分为G1期、S期、G2期和M期。

15、细胞系生长阶段包括：原代培养期（指从体内取出组织接种培养到第一次传代的阶段）、传代期（将原代细胞分开至多个新的培养瓶中，这个过程叫传代）、衰退期（转化的标志之一是细胞获得永久性增殖能力，

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成为连续细胞系）

16、每代细胞一般要经过三个生长阶段：（1）潜伏期、（2）指数生长期、（3）停止期。

17、细胞培养的常用液体：水（蒸馏水、离子交换水）、平衡盐溶液BBS（调节PH以及供给细胞生存所需的能量和无机离子成分、维持渗透压）、消化液（胰蛋白酶溶液、二乙烯四乙酸二钠溶液及胶原酶溶液）、消化酶抑制液（大豆胰酶抑制剂）、PH调节液（NaHCO3、HEPES溶液）、抗生素液（青霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素）、谷氨酰胺补充液。

18、培养基的营养成分：氨基酸（十二种必需氨基酸L型）、单糖（葡萄糖）、维生素（提供辅酶和辅基：生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B12）、其他成分（微量元素、核酸降解物、抗氧化剂）。

19、要求：PH7.2~7.4渗透压：290mOsm/kg

20、天然培养基：指主要来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基。包括：生物性液体（血清）、组织浸液、凝固剂（血浆）。

21、血清对维持体外细胞的生长具有极为重要的作用。血清的灭活：将血清解冻后，56°C孵育30min。 22、胶原主要用于细胞的附着，能改善细胞表面的性质，促细胞生长。

23、基本培养基种类包括：MEM、DMEM、IMDM、RPMI1640、199、109培养基HamF10、HamF12、McCoy’5A。

24、无血清培养基：指不需要添加血清就可维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。包括基础培养液（HamF12和DMEM的混合培养液）、添加组分（细胞外基质、营养成分、生长因子、酶抑制剂，具体包括：促贴壁物质“纤连蛋白FN、层粘连蛋白LN”、结合蛋白和转运蛋白、微量元素：硒）。 25、原代培养方法基本过程都包括：取材、培养材料的制备、接种、加培养液、培养。

26、组织细胞的分离：机械法（离心分离法、切割分离法、机械分离法）、消化法（胰蛋白酶消化法“Ca2+和Mg2+对其有抑制作用”、胶原酶消化法、螯合剂消化法“柠檬酸钠”、两酶混合使用效果好，浓度为（胰蛋白酶0.1mg+胶原酶0.25mg/ml）。

27、体外传代的细胞生长一代包括3个过程：潜伏期、生长对数期、平坦期。

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28、传代培养分为原代培养后第一次传代和常规传代两种方法。 29、常规传代包括贴壁细胞的消化法传代和悬浮细胞传代。

30、贴壁细胞传代应注意的问题：择适当时机进行传代；不同细胞的传代要区别对待；消化液浓度要适宜；次传代的细胞接种数量可适当多一些；部分贴壁生长细胞不经消化处理直接吹打也可使细胞从壁上脱落下来，而进行传代。

31、悬滴培养：组织块悬滴培养法，由Harrison于1907年创立。单盖片悬滴培养优点是活体观察时可以直接使用油浸物镜，缺点是操作时生长基质盖片既容易破碎又容易造成污染。

32、旋转管培养：就是将所培养的组织细胞接种在一管状培养器皿内，再将旋转管固定在一可旋转的装置上，边旋转边进行的一种培养方法。

步骤包括：取材、接种、凝固、加培养液、培养。

33、克隆培养法：又称作单细胞分离培养法，就是将从细胞悬液中获得的单个细胞用于培养，使之重新繁衍成一个新的细胞群体的培养技术。强调培养产物的单一性而排除异质性。

34、克隆培养法的步骤：首先要制备细胞悬液，通过连续稀释获得可用于培养的单个细胞，然后将单细胞悬液接种到培养皿中适当的生长基质表面，让细胞单独生长繁殖。、

35、影响克隆形成率的因素（接种众多单个分散细胞，经培养后能够增生形成克隆的百分数称为克隆率或接种率）：（1）接种细胞的密度、（2）培养基HamF12K为最好（3）血清、（4）饲养细胞，饲养细胞也称滋养细胞，是一层经过射线照射或丝裂霉素C作用后失去分裂能力，供其他细胞附着的细胞层。（5）激素和生长因子、（6）CO2、（7）适应性生长基质。

36、根据生长基质或培养物的性质或类型不同，常用的细胞克隆技术分为：

稀释铺板法、饲养层克隆法、胶原模板或血纤维蛋白膜层板克隆法、琼脂克隆法、多孔塑料培养板单细胞克隆法（克隆细胞的主要技术）。

37、细胞同步化：是指自然的或人工方法获得的细胞群体的细胞周期同步化生长。 38、选择细胞同步化时，将细胞进行分离和筛选的方法有： M期细胞震摇脱落法、离心洗脱法、梯度沉降法。

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39、诱导细胞同步化的方法有：血清饥饿法、异亮氨酸营养缺乏法、

DNA合成抑制剂阻断法、秋水仙素阻断法。

40、动物细胞大规模培养一般分为：分批式操作、流加式操作、半连续式操作、连续式操作和灌流式操作五种操作模式。

41、分批式操作（采用机械搅拌式生物反应器）优点：该方法操作简单、培养周期短、污染和细胞突变的风险小，既能直观地反映细胞生长代谢的过程，又可直接放大。

42、半连续式操作的特点：培养物的体积逐步增加；可进行多次收获；细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。优点：操作简便，生产效率高，可长时间进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。

43、连续式操作的特点：细胞维持持续指数增长；产物体积不断增长；可控制衰退期与下降期。不足：容易造成污染；细胞的生长特性以及分泌产物容易变异；对设备、仪器的控制技术要求较高。 44、灌流式操作常使用的生物反应器有：搅拌式生物反应器、固定床或流化床生物反应器。

45、灌流式操作的优点：细胞截流系统可使细胞或酶保留在反应器内，维持较高的细胞密度，一般可达107~109ml，从而较大的提高了产品的产量；使细胞稳定的处在较好的营养环境中，有害代谢废物浓度积累较低；反应速率容易控制，培养周期较长，可提高生产率，目标产品回收率高；产品在罐内停留时间短，可及时回收到低温下保存，有利于保持产品的活性。

46、细胞系：是由原代培养经初步纯化，获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。 47、细胞系和细胞株的鉴定指标：纯度、细胞学特征、稳定性、污染情况。鉴定方法有： （1）细胞形态学观察：光镜和电镜观察其形态特征； （2）绘制生长曲线，计算分裂指数； （3）染色体组型和带型分析； （4）同工酶酶谱检测。

48、低温液氮冻存是细胞培养最常用的技术（-196°C），甘油或二甲基亚砜DMSO等为 低温保护剂。

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49、细胞的运输方法：贴身运输、冰瓶运输、液氮罐运输。