摘要
目的探讨累加电针对神经痛大鼠的镇痛作用及胶质细胞源性神经
GFRα-1）营养因子受体（glialcellline-derivedneurotrophicfactorreceptor，在神经痛及电针治疗神经痛过程中转录水平及蛋白表达的变化。
方法
采用大鼠坐骨神经慢性限制性损伤（chronicconstriction
injury，CCI）动物模型，即在左侧坐骨神经中段用4-0羊肠线松扎四道，致CCI。应用辐射热刺激大鼠脚掌的测痛方法观察大鼠坐骨神经损伤后痛阈的改变，以缩爪潜伏期（pawwithdrawallatency，PWL）为指标，评判坐骨神经损伤致热痛敏的变化。观察累加电针对神经痛热痛敏的抑制作用，选取对侧环跳、阳陵泉给予隔日电针，持续2周，测量神经痛大鼠在长期给予电针前后PWL的变化。采用Trizol一步法提取大鼠L4-L6神经节总RNA，逆转录-聚合酶链式反应（reversetranscript-polymerasechainreaction，RT-PCR）技术观察大鼠神经痛前后及累加电针后，DNA电泳条带亮度的改变，从而判定GFRα-1合成的变化。运用L4-L6神经节及脊髓组织切片，ABC漂浮免疫组织化学染色的方法，观察正常、神经痛及电针大鼠神经节GFRα-1免疫阳性神经元数量的改变，反映其在受体
1新乡医学院硕士学位论文蛋白水平的变化。
结果神经痛模型大鼠手术后PWL明显降低，持续至少3周。术后第3天，大鼠PWL明显缩短，7天后稳定，表现为热痛敏（手术前9.93s±0.40s；术后第3天7.32s±0.80s；术后第7天6.00s±0.90s,P<0.01;术后第14天术后6.30s±0.70s,P<0.01;术后第21天5.70s±0.50s,P<0.01）。神经痛大鼠给予电针，从第3次电针后开始，与神经痛组相比，PWL明显延长，有显著性差异（神经痛组5.98s0.90s，神经痛+电针组第5天9.00s1.20s，P<0.05；第21天9.30s0.50s，P<0.01），逐渐达到模型前水平，持续2周。RT-PCR结果显示，在大约450bp位置出现GFRα-1DNA特异性条带，凝胶成像系统分析光密度表明其合成神经痛及电针后在第2周及第3周均明显增加（第2、3周正常组：0.200.04、0.230.02；神经痛组：0.330.04、0.350.02；电针组：0.400.05、0.440.03；P<0.05，P<0.01）。免疫组化结果显示，脊髓背角及背根神经节有GFRα-1免疫阳性神经元细胞着色，呈棕褐色，在模型、电针组大鼠免疫阳性细胞数目增加，有显著性差异（背根神经节第2、3周正常组：18.92.1、25.63.4；神经痛组：30.32.7、38.65.4；电针组：42.95.1、47.22.8。脊髓背角3周正常组：59.311.7、55.28.8；102.47.6、99.512.5；第2、神经痛组：电针组：127.34.7、130.211.8）。
结论长期电针对神经痛大鼠有良好的镇痛效果。在DRG和脊髓背角，GFRα-1mRNA表达水平及蛋白表达水平在神经痛发生后均显著增
2新乡医学院硕士学位论文加，给予神经痛大鼠电针治疗后，可以显著提高内源性GFRα-1的表达，提示GFRα-1参与神经痛及电针镇痛过程。
关键词神经痛；电针镇痛；胶质细胞源性神经营养因子；胶质细胞源性神经营养因子受体
3新乡医学院硕士学位论文ExpressionofGFRα-1inElectroacupunctureAnalgesiaonthe
NeuropathicPainRat
Abstract
ObjectiveToobservetheeffectofaccumulativeelectroacupuncture
（EA）ontheneuropathicpainrat.Toinvestigateexpressionchangesofglialcellline-derivedneurotrophicfactorreceptor(GFRα-1)inEAanalgesiaontheneuropathicpainrat.
Methods
Experimentalanimalmodelwasbuiltwithconstricton
chronicinjury(CCI)tosciaticnerveinrat,thatis,fourlooseligatureinthemiddleofleftsciaticnervewith4-0gutthread.Tostudychangesofthenociceptivethresholdaftersciaticnerveinjuryusingradiantheattoratpaw.Withpawwithdrawallatency(PWL)asindicatortoinvestigatechangesofneuropathicinducedhyperalgesia.InhibitoryeffectofaccumulativeEAwasstudied,stimulatedthe“huantiao”and“yanglingquan”attheeachotherdayfortwoweeksandmeasuredthechangesofPWLbeforeandduringneuropathicpain.
ThetotalRNAfromratL4-L6dorsalrootganglion
4新乡医学院硕士学位论文（DRG）wastakenwithtrizolone-stepmethod.Withreverse
transcript-polymerasechainreaction,thebrightnessofDNAbands（RT-PCR）innormal,neuropathicpainandEAgroupwereexploredtoshowwhetherthesynthesisofGFRα-1ischanged.StainingslicesfromL4-L6DRGandspinalcordwithABC-floatingimmunohistochemistry,changesofGFRα-1immunoreactivepositiveneuronsnumberwerelearnedtoshowreceptorexpressionindifferentconditions.
Results
PWLdecreasedsignificantly,andlastatleast3weeks.From
thethirddayafternerveinjury,PWLdecreasedsignificantlyandstaysstablefromtheseventhdayon,indicatingthermalhyperalgesia(beforeoperation9.93s±0.40s,thethirddayafteroperation7.32s±0.80s,theseventhdayafteroperation6.00s±0.90s,P<0.01;thefourteenthdayafteroperation6.30s±0.70s,P<0.01;thetwenty-firstdayafteroperation5.70s±0.50s,P<0.01).FromthethirdEAstimulation,PWLbegantoincreaseandwentbacktothebaseline,whichlastedfortwoweekswithsignificantdifferentchanges(neuropathicpaingroup:5.98s0.90s;EAgroupatfifthandtwenty-firstday:9.00s1.20s，P<0.05；9.30s0.50s，P<0.01).RT-PCRshowedthespecificDNAbandinthepositionabout450bp,indicatingthesynthesisofGFRα-1isincreasedafternerveinjuryinthesecondandthirdweekandincreasedfurtherafterEA(thesecondandthirdweeknormalgroup：0.200.04、0.230.02;neuropathicpain
5新乡医学院硕士学位论文group：0.330.04、0.350.02;EAgroup：0.400.05、0.440.03；P<0.05，P<0.01）。TherehavesomeGFRα-1immunoreactiveneuronswithbrowncolorinDRGandspinalcordshowingbyimmunohistochemistry.BothinneuropathicpaingroupandEAgroup,thenumberofGFRα-1immunoreactiveneuronsincreased（IntheDRGatthesecondandthirdweek：Normalgroup：18.92.1、25.63.4;neuropathicpaingroup：30.32.7、38.65.4;EAgroup：42.95.1、47.22.8.Inthespinalcordatthesecondandthirdweek：Normalgroup：59.311.7、55.28.8；neuropathicpaingroup：102.47.6、99.512.5；EAgroup：127.34.7、130.211.8）。
Conclusion
AcummulativeEAhasanalgesiceffectontheneuropathic
painrat.ExpressionGFRα-1increasedsignificantlyinDRGandspinaldorsalhornafterCCI-inducedneuropathicpainandcouldbefurtherenhancedbyEAtreatment,suggestingthatGFRα-1wasinvolvedinEAanalgesiaontheneuropathicpainrat.
KeywordsGFRα-1
neuropathicpain;electroacupunctureanalgesia;GDNF;
6新乡医学院硕士学位论文GFRα-1表达与电针治疗大鼠神经痛的关系研究
引言
胶质细胞源性神经营养因子（glialcellline-derivedneurotrophicfactor，GDNF）发现于1993年，是从大鼠神经胶质瘤细胞株B49提纯的一种神经营养因子
［1］
。GDNF分布于外周和中枢神经系统，其已知的功
［2-8］
能主要是对多种神经元具有营养、保护和促损伤后修复作用。GDNF
成熟蛋白由134个氨基酸残基组成，结构上属于转化生长因子β超家族（transforminggrowthfactor-β,TGF-β）成员。GDNF通过其受体系统实现向细胞内的信号转导：复合受体由位于细胞膜表面与GDNF具有高亲和力的结合受体GFRα-1（glialcellline-derivedneurotrophicfactor
［9,10］［］
receptor）GDNF与GFRα-1和跨膜的酪氨酸激酶受体RET11,12组成。
和RET形成复合物，引起Ret蛋白的磷酸化，从而进一步激活细胞内信号转导途径。
疼痛是临床大多数疾病的共同症状，病理性疼痛(包括慢性炎症痛及神经痛)，不仅给患者带来很大的痛苦，也是医学领域的一大难题。继20世纪90年代是“脑的10年”之后，美国已确定从2001年起的10年为“疼痛控制和研究的10年”（thedecadeofpaincontrolandresearch）。这一战略规划正在推动世界范围内疼痛研究和临床治疗的发展。神经源性病理性疼痛（neuropathicpain,简称神经痛）是指以沿周围神经通路及其分布
7新乡医学院硕士学位论文区慢性疼痛为主要特征的一种临床综合征。其周围神经根、神经节、神经丛、神经干或其分支的原发或继发性损害（如代谢性或机械性等因素）引起的痛觉过敏、痛觉超敏、痛感觉异常等感觉障碍。神经痛时，脊髓背角外周及中枢神经元形态及功能发生可塑性变化，伤害性传导增强，处于高敏状态。临床上常见的镇痛药物对神经痛的治疗效果都不十分理想。大量实验和临床观察证实，针刺是一种有效的镇痛方法，其具有安全、有效、副作用少、生理干扰小等特点，在临床上，针刺对慢性痛特别是神经痛有良好的镇痛效果[13-17]，针刺镇痛的机理研究将有助于寻求更好的治疗方法。
Yun等［18,19］研究表明内源性神经营养因子可能参与电针的调整效应，那么，内源性GFRα-1是否也在电针抗神经痛中起作用，这是本研究需要解决的主要内容。
本研究旨在坐骨神经慢性限制性损伤（chronicconstrictioninjury，CCI）导致神经痛大鼠模型上，观察多次电针对大鼠神经痛的治疗作用，并应用免疫组化、逆转录-聚合酶链式反应（reversetranscript-polymerasechainreaction，RT-PCR）等形态学及分子生物学技术，探讨神经痛不同时程及电针镇痛时GFRα-1在背根神经节（dorsalrootganglion，DRG）和脊髓背角的表达变化，以期为电针镇痛的机制研究提供理论依据。
1材料与方法
8新乡医学院硕士学位论文1.1材料
1.1.1实验动物雄性Sprauge-Dawley大鼠，体重200g20g，购自新乡医学院实验动物中心。饲养于12h光照/12h黑暗的环境中，自由摄食和饮水，在实验环境中适应1周后进行实验。1．1．2主要试剂
GFRα-1抗体，购自Sigma公司。anti-rabbit-HRP，购自SantaCruz公司。免疫组化ABC试剂盒购自Vector公司。
GFRα-1mRNA及β-actinmRNA上游、下游引物，由华美生物工程技术服务有限公司合成。
GFRα-1antisense:5’-ATTGGCACAGTCATGACTCCCAAC-3’,sense:5’-GAGGAGCAGCCATTGATTTTGTGG-3’;β-actinantisense:5’-TAACGCAACTAAGTCATAGT-3’sense:5’-CACCATGTACCCTGGCATTG-3’。其余化学试剂均为分析纯。1．1．3主要仪器
G6805-2型电针仪336型辐射热测痛仪德国莱卡1800恒冷切片机UV-2500紫外分光光度计
9上海医用电子仪器厂天津泰斯特仪器厂德国莱卡公司日本岛津公司
新乡医学院硕士学位论文4500-U数码相机AS-3120超声破碎仪DTC型扩增仪TGL-16G离心机PH213酸度计1．2方法
日本尼康公司
天津奥赛恩斯仪器有限公司西安天隆科技有限公司上海安亭科学仪器厂
北京哈纳科技有限公司
1．2．1建立神经痛大鼠模型大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉（40mg/kg）后，左侧后肢皮肤切开，肌肉钝性分离，暴露坐骨神经，在坐骨神经中段用4-0羊肠线松扎四道，致CCI神经痛大鼠模型，术后肌肉注射青霉素预防感染。
1．2．2测痛方法安静环境中，室温20℃±2℃，将大鼠放入336型辐射热测痛仪的玻璃格子中，全身可以自由活动。待大鼠静置20min后，用强光照射大鼠脚掌，测定大鼠的PWL，每间隔10min测定1次，取3次测定结果的平均值作为测定结果。为防止大鼠热辐射烫伤，将PWL的上限值（cut-offtime）定为20s。
1．2．3电针方法安静环境中，室温20℃±2℃，将大鼠躯干固定于木架上，头部与四肢可自由活动，待大鼠静置20min后，将针灸针刺入大鼠右侧“环跳”（GB30）与“阳陵泉”（GB34）穴，通过G6805-2型多功能电针治疗仪给予“疏密波”，疏波频率约4Hz，串长2.5s，密波频率约60Hz，串长5s，强度以引起大鼠后肢肌肉轻微抖动而不嘶叫为宜(≤1
10新乡医学院硕士学位论文mA)。
自CCI术后第7天起，隔日给予神经痛大鼠电针治疗，每次电针治疗时间为30min。1．2．4组织切片的制备
大鼠在戊巴比妥钠（剂量为40mg/kg）麻
醉下，左心室插管，依次灌入0.9%氯化钠200mL和4%多聚甲醛400mL，灌注完毕后取出L4-L6DRG和脊髓腰膨大段，置入20%的蔗糖（含4%多聚甲醛,4℃），4～6h后，换入30%蔗糖溶液(4℃)直至下沉。冠状冰冻切片，片厚30μm，切片放入保护液中，-20℃保存。1．2．5免疫组织化学法（ABC法）
1）将DRG和脊髓组织切片从保护液中取出；2）0.01MPBS中漂洗35min；3）0.3%H2O2中浸泡30min；4）0.01MPBS中漂洗35min；
5）封闭液（4%羊血清，4%TritonX100，1%牛血清白蛋白），37℃，20min；
6）加入兔抗GFRα-1抗体（1:1000），4℃孵育48h；7）0.01MPBS中漂洗35min；
8）加入生物素化的羊抗兔IgG（1:200）37℃孵育1h；9）0.01MPBS中漂洗35min；
10）加入AB液（A:B=1:1,1:200）37℃孵育1h；
11新乡医学院硕士学位论文11）0.01MPBS中漂洗35min；
12）0.1MTris-HCl（pH7.4）中平衡5min；13）0.05%3,3-二氨基联苯胺和0.03%H2O2中显色；14）0.1MTris-HCl终止反应；15）贴片，室温晾干；
16）无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
染色信号的特异性通过对照实验证实。不加一抗染色未见阳性信号。1.2.6总RNA提取（Trizol一步法）
1）动物断头处死，立即在冰浴上取出L4-L6DRG。
2）将单侧L4-L6DRG置于10mL消毒试管中，每50～100mg组织加入1mLTrizol试剂,冰浴中用玻璃匀浆器制备匀浆。
3）每1mLTrizol试剂加入0.2mL氯仿，快速震荡15s，冰浴5min，12000r/min，4℃离心15min，吸取上层水相转移到另一干净离心管内。
4）12000加入与水相等体积预冷的异丙醇，缓慢混匀，冰浴15min，r/min，4℃离心10min，弃上清，将离心管倒置在消毒滤纸上，吸干异丙醇。
5）加入75％乙醇，重悬沉淀，7500r/min，4℃离心8min，弃上清，在消毒滤纸上吸干乙醇。
6）重复步骤4，倾去乙醇，空气干燥。
7）干燥后将沉淀溶于DEPC水，置70℃贮存，沉淀加乙醇于20℃
12新乡医学院硕士学位论文可长期贮存。
8）取4L总RNA溶液稀释至1mL，UV-2500紫外分光光度计检测OD260和OD280值，测定其浓度和纯度。1.2.7RT-PCR
1)逆转录合成cDNA第1链。在0.2mL无RNase的PCR管中依次加Antisenseprimer(25pmol/L)1L；入以下试剂：总RNA(1g/L)3L；DEPC水(Rnase-free)调体积至12.5L。
70℃变性5min，冰浴5min。
5×RTbuffer4L；10mMdNTPmix2L；RNAsin0.5L；（20U/μL）M-MuLV逆转录酶（200U/μL）1L，42℃水浴45min，72℃水浴10min。
2）PCR扩增。在0.2mLPCR管中依次加入以下试剂：逆转录产物10L；10×buffer5L；MgCl2(25mM)1L；DNTPs(2.5mM)2L；Sense/antisenseprimer1l(each)；TaqDNA聚合酶DEPC（5U/μL）1L；94℃，5min；94℃，30sec；60℃，30sec，30个循环；72℃，水29L。
1min；72℃，7min；4℃保存备用。
3）DNA电泳鉴定及图像分析。PCR产物5L上样于1%琼脂糖凝胶，电压为100V，进行电泳。应用凝胶图像分析系统（GDS8000,GeneToolsfromSyngenesoftware）进行条带光密度分析，经β-actin校正得到相对光密度值。
13新乡医学院硕士学位论文1．2．8统计分析应用SPSS10.0计算机统计软件进行数据处理，所有数据均用平均值标准误（meansSE）表示，用单因素方差分析（onewayANOVA）进行数据比较，P＜0.05有显著性差异。1．2．9有关溶液的配制
1)0.1MPBS。Na2HPO430.8g、NaH2PO42.8g和NaCl8.5g溶于800mL双蒸水中，用5NNaOH调pH至7.2，加双蒸水至终体积1000mL，高压消毒。
2)0.01MPBS。Na2HPO43.08g、NaH2PO40.28g和NaCl8.5g溶于800mL双蒸水中，用5NNaOH调pH至7.2，加双蒸水至终体积1000mL。
3)4%多聚甲醛。多聚甲醛40g加入800mL0.1MPBS中，加热至溶解，用0.1MPBS定容至1000mL，滤纸过滤。
4)20%蔗糖。蔗糖20g溶于80mL0.1MPBS中，用0.1MPBS定容至100mL，高压消毒。
5)30%蔗糖。蔗糖30g溶于80mL0.1MPBS中，用0.1MPBS定容至100mL，高压消毒。
6)TE。1MTris-HCl(pH8.0)10mL,0.5MEDTA(pH8.0)2mL,加双蒸水至终体积1000mL,高压消毒。
7)1MTris-HCl。Tris60.5g，双蒸水400mL，根据所需pH值，选择：浓HCl37.5mL(pH7.5)；浓HCl21mL(pH8.0)；浓HCl2mL(pH
14新乡医学院硕士学位论文9.5)。用双蒸水定容至500mL，高压消毒，室温保存。
8)0.5MEDTA。EDTA186.1g加双蒸水800mL，加热至60C，冷却后调pH至8.0，用双蒸水定容1000mL,高压消毒。
9）5×TBE电泳缓冲液。Tris54g，硼酸27.5g，0.5MEDTA1mL，双蒸水定容至1000mL。2结果
2．1神经痛大鼠模型建立后缩爪潜伏期变化情况采用336型辐射热测痛仪测定大鼠的缩爪潜伏期(pawwithdrawallatency,PWL)，术后大鼠PWL明显降低，持续至少3周（图1）。术后第3天，大鼠PWL明显缩短，表现为痛敏，第7天痛敏稳定。
缩爪潜伏期（秒）******图1坐骨神经慢性限制性损伤后大鼠缩爪潜伏期的变化。**与正常组相比P＜0.01……
15新乡医学院硕士学位论文3讨论
中医理论认为，坐骨神经痛属“筋痹”范畴。因风寒、湿热之邪痹阻经脉，或跌扑闪挫引起经脉气滞血瘀所致。本实验中，采用结扎大鼠坐骨神经主干作为神经痛模型，则此痹主要由气滞血瘀引起，气血不通，不通则痛。故治疗当以疏经通络，取穴则以循经取穴为主。中医临床的针刺镇痛已有数千年的历史。实践证明，针刺与其他镇痛方法相比确实具有安全、简便、经济、有效等优点，是较为温和的生理性镇痛方法，并且还兼有调节机体各种生理功能的效应。因此，针刺对于治疗神经痛是一种较为理想的手段。
针刺是通过针刺信号和疼痛信号在外周和中枢神经系统不同层面发生整合，从而起到镇痛作用。按经络辩证主要为足少阳胆经和足太阳膀胱经，因此选用环跳、阳陵泉二穴。环跳是足少阳胆经与足太阳膀胱经之会穴，亦是临床上常用来治疗坐骨神经痛的主要穴位。阳陵泉为八会穴之一，筋会阳陵泉，这两穴均易得气。“气达病所至速效”。临床资料也证实，此两穴对神经痛患者有较好的治疗效果。国内外临床和动物实验均表明，针刺对神经痛有很好的治疗作用
［20-23］
。
有关神经痛产生的外周和中枢机制一直是近年来痛觉研究的热点之一。国内外大量研究表明，许多外周和中枢结构及多种化学物质可能参与了神经痛的形成及调制过程
……
［24-31］
。神经损伤导致的神经系统内许多生
16新乡医学院硕士学位论文4结论
（1）多次电针对大鼠神经痛有较好的治疗作用。
（2）在DRG和脊髓背角，GFRα-1的蛋白及mRNA表达水平在神经痛发生后均显著增加，给予神经痛大鼠电针治疗后，可以进一步显著提高内源性GFRα-1的表达。
17新乡医学院硕士学位论文参考文献
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GDNF及其受体与疼痛
摘要胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)是TGF-β超家族成员。具有多种重要的生物学活性，不仅特异性地促进多巴胺能神经元的存活，还对外周神经系统及非神经系统具有广泛的作用。本文就GDNF及其受体在神经系统中的作用，特别是痛觉调制中的作用近年来国内外研究进展作一综述。
关键词GDNF；GFRα；神经痛；痛觉调制
胶质细胞源性神经营养因子(glialcellline-derivedneurotrophicfactor，GDNF)是1993年从大鼠神经胶质瘤细胞株B49中发现并提纯的一种神经营养因子[1]。GDNF成熟蛋白由134个氨基酸残基组成，结构上属于转化GDNF通过一个复合受体系统实现向细胞生长因子β超家族(TGF-β)成员。
内的信号转导。该复合受体系统包括:位于细胞膜表面与GDNF具有高亲和力的结合受体GFRα1[2,3]和跨膜的酪氨酸激酶受体RET[4,5]。GDNF与GFRα1和RET形成复合物，引起Ret蛋白的磷酸化，从而进一步激活细胞内信号转导途径。GDNF在外周和中枢神经系统广泛分布，对多种神经元具有营养、保护和促损伤后修复作用[6-12]。在DRG，GDNF对一部分伤害性感受初级感觉神经元具有重要的营养、保护作用，并且GDNF
21新乡医学院硕士学位论文被证明可以翻转这些伤害性感受神经元在外周神经损伤后发生的可塑性变化[12]。近来，越来越多的证据表明GDNF可能在痛觉信号的传导与调制中起重要作用1GDNF概述1．1
GDNF家族
GDNF是一种含有二硫键的同源二聚体分泌型蛋白
[12-18]。
质，其前体蛋白含有18个氨基酸残基的信号肽序列，经加工后其成熟蛋白含有134个氨基酸残基，其中含有2个N-糖基化位点，同源二聚体是其活性形式，分子量约为32～42KD。虽然GDNF氨基酸结构中含有与TGF-β结构相似的7个半胱氨酸残基，而且这些半胱氨酸残基所处的空间位置与所有TGF-β超家族成员相同，但二者氨基酸序列的同源性不到20%，所以，GDNF为TGF-β家族的一个远系成员[19]。GDNF肽链内在结构上有2个β-折叠和一个α螺旋，其中α螺旋带正电荷，而β-折叠带负电荷，这一结构特点在GDNF与其受体的相互作用中有重要意义[20]，人GDNF基因位于第5号染色体的短臂5p12-13.1上，含有2个内含子和3个外显子，其基因全长约为12kb[21,22]。近年来，又陆续发现了GDNF家族的一些新成员，继1996年Kotzbauer等[23]从中国仓鼠卵巢细胞的条件培养基中发现了一种具有促进神经元存活的物质后，经分离、纯化得到一种分子量为25KD的新的蛋白质，称为Neurturin(NTN),第2年，他们同时克隆到了人及小鼠的NTN基因，人NTN(hNTN)的前体蛋白由197个氨基酸组成，其N端的19个氨基酸为信号肽，成熟NTN蛋白由102个氨基
22新乡医学院硕士学位论文酸组成，其活性形式亦是通过二硫键形成的同源二聚体，与GDNF具有42%的同源性[24]。1998年Milbrandt等[25]利用简单PCR方法及人cDNA文库筛选，克隆到了小鼠的PSP基因，该基因编码156个氨基酸的前体蛋白，N端为信号肽，其后为前体区，成熟PSP蛋白含有96个氨基酸，其氨基酸顺序与GDNF和NTN的同源性为40%，一级结构也有7个保守的半胱氨酸；在神经系统内也有广泛的表达，包括皮质、海马、纹状休小脑等。GDNF家族的第4个成员Artemin(ART)的成熟多肽由113个氨基酸构成，其蛋白的一级结构与GDNF、NTN、PSP相似，具相对位置相同的7个保守的半胱氨酸残基，全长ART蛋白亦是由信号肽、前体区和成熟蛋白3部分组成，与GDNF的同源性约为36%，与NTN、PSP的同源性约为45%,ART基因定位于人1号染色体短臂1p32-33[26]。1．2
GDNF受体及信号转导
GDNF是分泌性蛋白，所以，其对细
胞的营养作用必须通过跨膜信息传递作用即受体介导才能实现。GDNF家族受体由2部分组成，第一部分是与糖基化的磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidylinosital,GPI)偶联的锚定到细胞表面的直接与GDNF结合的蛋白质分子，该类蛋白质分子称为GDNF家族受体α(GDNFfamilyrecepteralpha,GFRα)[27]；另一部分为原癌基因c-Ret编码的具有跨膜作用的酪氨酸激酶Ret[28]。GDNF家族各成员的Ret是一样的，但是GFRα是不相同的，前者特异性地结合GDNF家族成员，促使Ret磷酸化，磷酸化的Ret顺序激活其下游的丝裂酶原活化蛋白激酶(mitogen-activated
23新乡医学院硕士学位论文proteinkinase,MAPK)等，导致一系列胞内途径的激活，从而发挥其生理GFRα2、GFRα3、GFRα4。功能[29]。目前发现GFRα大约有4种，即GFRα1、分别与不同的GDNF家族神经营养因子结合，GDNF主要结合GFRα1。由于GFRα1为分布于细胞外表面的受体蛋白，因此GDNF与GFRα1结合后形成复合体，借助与跨膜受体酪氨酸激酶Ret将信号传导到细胞内
[30]。但是，GDNF在神经细胞内的信号转导可能不依赖于跨膜受体Ret，
而是通过激活细胞内Src蛋白激酶，使CREB(cAMPresponseelement-blindingprotein)磷酸化[31]。目前发现，GFRα1、RET在细胞分布上存在不一致性，在多巴胺神经元如黑质、腹侧被盖部神经元中2种受体均有表达，这种RET和GFR同时表达于同一细胞的作用方式，称为顺式作用；而在小脑、下丘脑核团中只有RET而无GFR的表达，是一种受体表达于投射神经元，而另一种受体表达于靶细胞上，这种作用方式称为反式作用。这2种分布方式的存在表明：GFR可能并不是以GDNF作为唯一的配体，可能尚有其他与GDNF类似的配体以GFR为受体。1.3GDNF及受体在中枢神经系统的表达与分布
在胚胎发育过程中，
GDNF在中枢神经系统的表达非常丰富，实验发现，GDNFmRNA在胚胎期的纹状体、海马、苍白球、小脑等广泛区域内表达。经RT-PCR检测，发育中的大鼠，其皮层、纹状体、小脑、海马、间脑、脊髓中都有GDNF存在。出生后，GDNF的表达不断下降，至成年则表达很少[32]。Golden等[33]采用原位杂交的方法检测成年小鼠中枢神经系统中GDNF及受体的
24新乡医学院硕士学位论文表达，发现GDNF及受体的mRNA主要表达于神经元，GDNFmRNA表达的量较低，在前脑皮质、纹状体、海马、小脑颗粒层及蒲肯野细胞层、丘脑、下丘脑、脊髓中都有GDNFmRNA的表达。而正常大鼠脑内GDNF家族的2种受体GFRα1和RetmRNA在前脑皮质、小脑、海马等处有少量的表达。在脊髓中RetmRNA主要表达在脊髓前角运动神经元中，而GFRα1mRNA则广泛表达在脊髓神经元及胶质细饱；目前关于GDNF蛋白在正常大鼠中枢神经系统中的分布研究尚不多，国内周雪等[34]应用免GDNF在大脑皮质疫组化法观察GDNF在成年大鼠CNS中的表达发现，
各层内呈弥散分布、阳性反应极弱;在小脑蒲肯野细胞中呈强阳性反应;此外，在脊髓前、后角、灰质联合中的神经元及神经胶质细胞中均有强阳性表达信号。2GDNF的作用机制2.1GDNF受体α1
为了探明GFRα1在GDNF保护效果中的作用，
Tomac等[35]应用目的基因突变产生缺失功能性GFRα1的小鼠，发现这些小鼠与GDNF-/-和Ret-/-小鼠表现出的行为障碍相似。Wang等[36]发现，由GFRα1缺失突变的纯合子小鼠(-/-)于继发于肾发育不全所导致的尿毒症，
在出生后24h内死亡；而有少量GFRα1受体的杂合子动物(+/-)却能存活GDNF或者胎肾组织移植后的(+/-)动物在脑缺血后，下来。其神经保护作用与野生型(+/+)的相比明显降低，由此可见GDNF或胎肾组织移植所发挥的神经保护作用至少有一部分是通过GFRα1而起作用的。
25新乡医学院硕士学位论文2.2NMDANicole等发现，在培养皮质神经元时，GDNF可以通过激
活有丝分裂原激活蛋白(mitogen-activatedprotein,MAP)激酶途径减少NMDA引起的钙离子内流和兴奋毒性神经元的死亡[37]，同时GDNF预处理也能减少海马脑片由于NMDA诱导的神经细胞死亡[38]。与缺血性死亡相似，应用亚惊厥剂量的NMDA和海藻酸可以增强GDNF的表达[39]。由于缺血性损伤包括EAAs的释放以及他们的受体的激活，所以GDNF的保护效应有可能是通过在体内减轻NMDA的反应而发挥作用的。2.3
一氧化氮
一氧化氮(nitricoxide,NO)在缺血再灌注损伤中是一种
重要的第2信使。根据酶的来源不同，有3种同型的NOS:神经元型NOSnNOS或NOS-1)、（neuronalNOS，诱导型NOS（inducibleorimmunologicNOS,iNOS或NOS-2)和内皮型NOS(endothelialNOS，eNOS或NOS-3)。nNOS和eNOS都是构成型的，需要钙离子的参与，而iNOS是不需要钙离子参与的，iNOS在炎性反应中对NO的释放起作用。在这些NOS种类中，nNOS参与了GLU和NMDA诱导的毒性[40]，例如缺乏nNOS的小鼠皮质神经元可以减少NMDA引起的毒性[41]。Wang等[36]发现，局部应用NMDA能诱导体内脑皮质或体外培养的皮质神经元释放NO，这种效应可以用NOS抑制剂L-NAME预处理所阻断；同时还发现MCAO引起脑皮质缺血后，皮质释放出NO，用NOS抑制剂L-NAME或者NMDA拮抗剂氯胺酮、MK801预处理后可以阻断缺血时NO的释放[42]。局部应用硝普盐也会产生NO，而这不会被氯胺酮所阻断。用NOS抑制剂
26新乡医学院硕士学位论文7-NINA(7-nitroindazolemonosodium)预处理可以显著减少缺血诱导产生的NO以及脑梗死。富含胶质细胞的脑皮质神经元培养后对NMDA的反应较弱，表明在皮质神经元培养过程中，NMDA诱导NO产生主要是由激活了nNOS而产生的[43]。由上可知，MCAO引起的NO释放，其机制包括NMDA受体和nNOS的激活[44]。
研究发现，GDNF在神经损伤中可以抑制NOS的活性[45]减少NO本身引起的毒性[46]。成年大鼠面神经或脊髓运动神经元受损后，应用含有GDNF基因的腺病毒载体，可以促进其存活[45,47]。在面神经撕脱伤后用GDNF病毒载体处理，可以显著抑制NOS活性，减少面神经运动神经元的缺失，使得胆碱乙酰转移酶免疫活性达到正常。可见，含有GDNF基因的腺病毒载体会保护周围神经损伤，这种效应是通过抑制NOS而实现的[45,47]。
GDNF预处理后可以显著减少MCAO及再灌注产生的NO。利用原位杂交和免疫标记方法[48]发现，在非缺血的海马和脑皮质中未发现GFRα1/nN0S双标记的神经元，但有单一标记GFRα1或nNOS的神经元，所以GDNF可能通过与NMDA相互作用间接抑制nNOS活性。另一方面，nNOS阳性在卒中动物再灌注15min后就可发现nNOS的免疫活性增强，细胞增多[49]。2.4凋亡和坏死
在多巴胺能神经元中，GDNF诱导的神经保护作用机
，51]制包括抗凋亡机制[50。利用终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导的原位缺
27新乡医学院硕士学位论文口末端标记(terminaldeoxynucleotidyltransferase(TdT)-mediateddUTPnickend-labelling,TUNEL)技术证实GDNF蛋白在大鼠永久性MCAO或短暂性血管阻塞前应用，可以减少缺血引起的DNA降解[52，53]以及脑水
肿[54]。在MCAO前，用复制-缺陷腺病毒载体或者重组的与腺相关的病毒载体(含有GDNF基因)，可以减少同侧大脑皮质或纹状体中的TUNEL阳性细胞、免疫反应性caspase-3以及细胞色素C阳性神经元[55-57]。这表明，对卒中动物而言，GDNF诱导的神经保护作用机制包括抗凋亡和抗坏死机制。
3GDNF及其受体与疼痛3．1
GDNF及其受体在痛觉调制中的作用
近来，越来越多的证据
表明GDNF可能在痛觉信号的传导与调制中起重要作用。在胚胎早期发育中，大约70%～80%的DRG神经元表达trkA受体并对NGF起反应。出生后，这个数量减小到40%～50%。丢失trkA的主要是中、小细胞直径的神经元(伤害性感受初级感觉神经元)，它们转为表达GFRa-1和ret受体系统，由对NGF起反应变为对GDNF起反应，这些神经元发出无髓和细的有髓神经纤维投射到与伤害性感受密切相关的脊髓背角的第II层
[10，12]。在外周神经系统和脊髓，GDNF及其受体系统与P物质、降钙素
基因相关肽(CGRP)、钠离子通道等与痛感受密切相关的生物活性物质和结构共存[58，59]GDNF对DRG中一部分伤害性感受初级感觉神经元具有。
重要的营养、保护作用，并且GDNF被证明可以反转这些伤害性感受神
28新乡医学院硕士学位论文GDNF对神经肽Y经元在外周神经损伤后发生的可塑性变化[11,12]。（NPY)、生长抑素(SOM)、钠离子通道等与痛感受密切相关的生物活性物质和结构的表达和功能有调节作用[13,14,60-62]。
已有证据表明，GDNF对SOM的功能和表达有显著影响。外源性给予GDNF可以显著增加DRG中表达SOM的神经元数目，并且增加SOM在脊髓背角的释放[61-63]。SOM是一种内源性的镇痛物质。在DRG,SOM主要存在于表达GDNF受体系统的伤害性感受初级感觉神经元中[64]，这些神经元发出神经纤维投射到脊髓背角第II层。当这类神经元的外周神经感受到伤害性刺激后，SOM从中枢端神经纤维末梢释放到脊髓背角，对脊髓背角的伤害性感受神经元发挥抑制作用[65]。SOM通过抑制伤害性刺激引起的脊髓背角神经元的放电，从而产生镇痛作用。以往许多临床和动物实验均证明SOM对多种病理性疼痛具有镇痛作用[66-68]。临床上，SOM的稳定类似物奥曲肽被用于治疗多种急慢性疼痛。3．2
GDNF及其受体与神经痛
有关神经痛产生的外周和中枢机制一
直是近年来痛觉研究的热点之一。国内外大量的研究表明，许多外周和中枢结构及多种化学物质可能参与了神经痛的形成及调制过程[69-72]。神经损伤导致的神经系统内许多生物活性物质的可塑性变化被认为在神经痛的形成及调制中起重要作用，这些生物活性物质包括一些神经递质、生长因子、细胞因子以及他们的受体[73-80]等等。一方面，一些生物活性物质的可塑性变化可能在神经痛的病因学中起作用，比如NPY和血管紧
29新乡医学院硕士学位论文张素（VIP)[81,82]在神经痛时表达上调，可能参与了神经痛的形成；另一方面，一些活性物质可能在神经痛发生时起到拮抗痛觉过敏的作用，比如甘丙肽(GAL)[83,84]在神经痛时表达上调，可能起到一定的拮抗痛觉过敏作用。以往的研究表明，神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)系统在神经痛的发生和维持中可能起到促进痛觉过敏的作用[85]。NGF以及它的高亲和力受体TrkA在CCI导致的神经痛发生以后表达也是增加的[86-88]，NGF及受体的表达上调，不过，与GDNF系统的拮抗痛觉过敏作用不同，可能是促进神经痛发生和维持的原因之一，因为给予NGF的中和性抗体或者TrkA的受体拮抗剂，可以减轻大鼠神经痛。在DRG中，尽管一部分神经元表达GDNF蛋白，但无法检测到GDNFmRNA在神经元的表达，倒是神经元周围的胶质细胞(雪旺细胞和卫星细胞)有GDNFmRNA的表达，并且在外周神经损伤后，GDNFmRNA表达增加[89,90]。按照经典的神经营养理论，由接受神经支配的靶细胞合成、分泌神经营养因子，被神经末稍摄取，然后逆向转运至神经元胞体，激活信号转导途径，促进神经元的存活[91]。与经典理论不完全相同，以往研究表明GDNF在轴突中是双向转运的[92]。一方面，接受神经支配的外周靶器官有较多的GDNFmRNA表达，GDNF蛋白也有在轴突中逆向转运的现象[93,94]。另一方面，有研究发现，在DRG由胶质细胞合成、分泌的GDNF可以被神经元摄取并顺向转运至外周和中枢末端[92,95]。GDNF与NGF系统在痛觉调制中作用的差异可能来自于多个方面。结构上，GDNF属于转化生长因子β超家
30新乡医学院硕士学位论文族(TGF-β)成员，通过与GFRα1结合激活与之偶联的酪氨酸激酶受体Ret实现信号转导；NGF属于神经营养素家族成员(neurotrophinfamily，包括NGF、BDNF、Nt-3、Nt-4、Nt-5)，通过酪氨酸激酶受体TrkA实现信号转导。在外周神经系统，DRG中司痛觉感受功能的小直径神经元可以分为2个亚群:其中之一表达NGF高亲和力受体TrkA,存活依赖NGF，含有兴奋性肽类递质，如递质P物质、降钙素基因相关肽；另一个亚群表达GDNF的受体，存活依赖NGF，正常情况下大部分不表达兴奋性肽类递2类伤害性感受神经元发出初级传入神经纤维投射至脊髓背角的不同质。
层面:GDNF依赖神经纤维投射至脊髓背角第II层的深部，不同于NGF依赖神经纤维投射部位[96]。外源性给予NGF可以使NGF依赖神经元中的P物质、降钙素基因相关肽表达增加，并且在脊髓背角的释放也增加，这可能是NGF促进痛觉过敏的机制之一[97]。而外源性给予GDNF能抑制对中枢有兴奋作用的神经肽Y的表达，提高抑制性神经递质SOM的表达。所以，尽管NGF依赖和GDNF依赖2个神经元亚群都起痛觉感受功能，它们在痛觉传导与调制中的作用可能大不相同。有一点需要指出的是，对于外周神经损伤导致病理性疼痛时内源性SOM的表达变化，以往的研究结果存在争论，有的实验表明神经痛发生时SOM表达上调[98]，相反的报道认为神经痛发生时内源性SOM表达是下降的[99]，也有实验室在脊神经结扎神经痛大鼠模型上检测到内源性SOM的表达无显著性变化
[100]。
31新乡医学院硕士学位论文一系列的试验表明，外源性给予GDNF或者通过转基因技术使动物体内高表达GDNF，都对神经痛有较好的治疗作用[18,60,101]。但脊髓蛛网膜下腔给予针对GFRα1的反义寡核苷酸后，DRG及脊髓背角GFRα1的表达均被部分阻断，所以，难以确定GDNF及GFRα1是主要在中枢还是外周起作用。很可能的是GDNF及GFRα1在外周和中枢均起作用，从而拮抗痛觉过敏。
GDNF及其受体也可能通过其他机制在神经痛时起到拮抗痛觉过敏的作用。比如：（1）GDNF可以抑制伤害性刺激引起的脊髓背角神经元的活化[101]；（2）GDNF可以抑制外周神经损伤后，A类神经纤维向脊髓(3)外周背角第II层出芽[12]，而后者被认为是神经痛的发病机理之一[102]；Na离子通道亚单位Nav1.3表达上调，神经损伤后，可能参与了神经痛的发生，GDNF可以反转神经损伤导致的Nav1.3表达上调，这也被认为可能是GDNF拮抗痛觉过敏和痛觉超敏的重要机制之一[18,103]；(4)GDNF可以阻断神经损伤引起的粗的有髓传入神经纤维的异位放电，从而抑制病理性疼痛的发生[18]；（5）GDNF可以抑制神经痛时NPY的表达上调，从而抑制痛觉过敏的发生[60]。
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35新乡医学院硕士学位论文攻读学位期间发表文章情况
作者（全体作者，按顺序排列）徐刚珍，丰慧根发表或投稿刊物名称、级别发表的年月卷期、起止页码被索引收录情况序号题目1GDNF受体表达与电针治疗大鼠神经痛的关系研究拟投稿2徐刚珍，丰慧根中枢5-羟色胺系统在痛觉调制中的作用拟投稿注：1、填写在学期间已发表（包括已接受待发表）的论文，以及已投稿、或已成文打算投稿、或拟成文投稿的论文情况（只填写与学位论文内容相关的部分）：2、“发表的卷期、年月、页码”栏：（1）如果论文已发表，请填写发表的卷期、年月、页码；（2）如果论文已被接受，填写将要发表的卷期、年月；（3）以上都不是，请据实填写“已投稿”，“拟投稿”。36新乡医学院硕士学位论文致谢
37新乡医学院硕士学位论文个人简历
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