质粒拷贝数的测定方法

生物技术通讯

LETTERS IN BIOTECHNOLOGY 1999年 第10卷 第1期  Vol 10 No.1 1999

质粒拷贝数的测定方法

周 涛

摘要 在研究生物工程重组蛋白产量的过程中，质粒的拷贝数是一个需要重点考虑的参数，对它进行精确定量至关重要。本文概述了几种主要的测定方法的原理和特点。 关键词 质粒拷贝数；测定方法

Determination methods of plasmid copy number

Zhou Tao

(Institute of Biotechnology, Beijing,100071)

Abstract Plasmid copy number, the number of expression vectors in each cell, is a key parameter in the study of productivity of recombinant

microorganisms. Recognition of the importance of this parameter has given rise to a number of methods for its determination. this article focuses on the principles and charactistics of these methods.

Key words plasmid copy number; determination method

细菌质粒是双链、闭环的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒在一般情况下对宿主细胞的生存不是必需的，但质粒含有某些基因，可以补充细菌基因的不足，有利于细菌的生存。质粒DNA的复制要由复制细菌染色体的多种酶共同完成，在宿主中复制的程度差异很大。质粒拷贝数指的是每个细胞中所含的质粒的个数。低拷贝数的质粒DNA在宿主细胞分裂前只能复制1～2次，而多拷贝数质粒可以在细胞分裂前复制成10～200拷贝。

质粒的拷贝数依赖于各种胞内外因素：质粒拷贝数首先决定于自身的遗传性，控制质粒拷贝数的基因位于一个包括DNA复制起点在内的质粒DNA的区域内。其次，质粒的拷贝数也受细胞生长条件的影响。细胞的生长速率增大时，质粒的拷贝数下降，主要是因为在高比的生长速率下，质粒的复制速度跟不上细胞分裂的速度，从而质粒拷贝数不断下降［1］。此外，培养时的温度和培基的组成都对质粒拷贝数有影响，比如当营养物限制或缺乏时会使质粒的拷贝数下降［2］。为了降低高拷贝数质粒的代谢负担，Remaut等构建了一种所谓潜复制的质粒，在正常情况下每个细胞只有1个拷贝，经诱导后其浓度可达到每个细胞1000拷贝［3］。

一般来说，外源基因的表达量随拷贝数的增加而提高，但是当拷

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贝数很大时，拷贝数与发酵目标产物产率的这种关系却不存在了

［4］

。这主要有两方面的原因：一方面，高拷贝数时外源基因的表达量不再由质粒的拷贝数决定，可能是由转录和翻译水平决定的；另一方面，高拷贝数的质粒往往很不稳定。由于质粒拷贝数的变化直接与基因目标产物的产率有关，因此对于重组蛋白的生产来说，质粒的拷贝数是一个非常重要的参数。那么迫切需要解决的问题就是如何准确地测定胞内质粒的拷贝数。现在已经发展了一些测定的方法，大致可以归纳为两类：一类是直接进行测定的方法，包括一些物理分离的方法和杂交的方法；另一类就是间接测定的方法。下面对这些方法做一个简单的介绍。

1 物理分离的方法

物理分离的方法就是将质粒DNA与染色体DNA进行分离并定量。将质粒DNA与染色体DNA分开主要是基于质粒DNA的两大特性：①质粒DNA是以共价闭合环状的形式存在，与染色体DNA的线状形式不同；②质粒DNA的分子量比染色体DNA要小得多。这些方法主要包括：氯化铯-溴化乙锭平衡梯度离心法、凝胶电泳法、高效液相色谱法以及毛细管电泳法等。

1.1 氯化铯-溴化乙锭（CsCl-EB）平衡梯度离心法

CsCl-EB平衡离心法是早期经常采用的方法，这种方法分离质粒和染色体DNA，是因为EB与线状和闭合环状DNA分子的结合量有所不同。EB通过嵌入碱基之间与DNA结合，进而使双螺旋解旋，由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加，从而阻止了EB分子的继续嵌入。但线状分子则不受限制，可继续结合更多的染料，直至达到饱和，即每两个碱基对大约结合一个EB分子。正是由于染料结合量的差别，使得线状和闭环DNA分子在含有饱和量EB的CsCl梯度中的浮力密度有所不同，从而达到分离的目的。

如果在细菌的培基中预先加入放射性标记的物质，那么根据回收的DNA条带的放射性强度可以进行定量分析。1965年，Dewitt在CsCl梯度离心后采用了分部收集的方法，将离心后的产物按密度梯度由高到低分成若干个部分，每部分取出一定的量进行液闪测定。如图1所示，浮力密度由右到左逐渐增大，前面的“卫星”峰即为质粒DNA峰。而且分部越细，测定结果的精确度越高。Clewell及其同事利用这种方法进行了大量的试验，发现放射性物质的回收率有很大的差别，从68%到90%不等［5,6,7］。根据质粒DNA峰的面积与染色体DNA峰面积的比值即可计算质粒的拷贝数。

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图1 CsCl-EB平衡梯度离心法分离菌株S.faecalisDS-5 DNA粗提液

［5］ CsCl-EB梯度离心法一般需要在超速条件下离心较长时间，比如用垂直转头UTi65需要以45 000 r/min离心16 h，用角转头则时间更长，Ti50以45 000 r/min离心48h，Ti65以60 000 r/min离心24 h，Ti70.1以60 000 r/min离心24 h等等，因为只有这样才能获得较满意的密度梯度。

用CsCl-EB梯度离心法来测定最大的缺点就是分部困难，回收率不稳定，并且十分费时，因此一般都不用来定量，而只做纯化回收质粒之用。

1.2 凝胶电泳（Gel electrophoresis, GE）

琼脂糖和聚丙烯酰胺是常用的两种凝胶基质。聚丙烯酰胺分离小片段DNA（5～500 bp）效果最好，分辨力极高，相差1 bp的DNA片段就能分开。琼脂糖凝胶的分辨能力比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广，从200 bp到50 kb，同时琼脂糖凝胶的制备与操作都比聚丙烯酰胺凝胶容易，因此，分离DNA通常都采用琼脂糖凝胶电泳。

由于在中性pH的电泳缓冲体系中，DNA分子带负电荷，从负极向正极移动，迁移率的大小与DNA分子大小及立体构象有关。并且在相同电泳条件下，按照Modsnad模型，小分子是以直线泳动的， 而大分子则以曲线泳动，因而小分子泳动速度较大分子迅速，这样，质粒DNA与染色体DNA就得到了分离。Wesblum［8］等首先利用了凝胶电泳的这一特性来测定质粒的拷贝数。他们将培养物进行放射性标记，凝胶电泳后测定各条带的放射性强度。Projan［9］等人采用荧光标记DNA，通过测定标记物的荧光强度代替测定放射性强度，从而扩大了这一方法的应用范围。

测定荧光强度来确定质粒的拷贝数的方法主要有3个步骤：①琼脂糖凝胶电泳分离细胞裂解液；②溴化乙锭染色；③色谱扫描仪扫描电泳条带。可以直接扫描凝胶，也可以扫描凝胶照相后的底片，但无疑

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前者的准确度要高一些，因为扫描底片时除了要考虑荧光信号以外还有胶片敏感性的影响。如图2，是一典型的凝胶扫描图谱。利用扫描后的质粒峰与染色体DNA峰的面积比即可计算质粒的拷贝数。

图2 双波长色谱扫描仪扫描凝胶条带的图谱［9］

在这一方法中影响测定结果的因素主要有：①加样孔中样品的残留；②染色体DNA对质粒DNA的粘附。由于染色体DNA比质粒DNA大得多，且非常粘稠，因此它能阻止质粒迁移到特异的位置；③染色与脱色的过程。其中染色过程的影响不大，因为只要染色时间足够长，染料与DNA的结合就可以达到饱和状态。脱色过程对双螺旋DNA的影响比对线性DNA的影响要大。脱色30min后，由于洗去了本底的干扰，荧光的吸收值达到最高，到120min一直维持平台期，之后双螺旋的吸收值明显降低而线性的变化不大；④DNA构象的不同，等量的双螺旋DNA与线性DNA的面积是不相同的，后者大约为前者的1.36倍。由于以上因素的存在，该方法测定的误差范围是±20%。Guerrini等认为采用脉冲电场凝胶电泳，可以减少染色体DNA和质粒DNA在琼脂糖基质中的残留，以提高测定结果的准确度。另外，为减少DNA提取过程中的损失，可用低熔点琼脂糖栓塞法，将细胞去壁后在原位裂解，然后直接进行电泳［10］ 。1.3 高效液相色谱（high-pressure liquid chromatography, HPLC）

高效液相色谱分析是60年代末70年代初发展起来的一项快速分离分析技术。用这种方法测定质粒的拷贝数，是通过羟基磷灰石

（hydroxylapatite, HPHT）的柱子来实现的。羟基磷灰石对核酸有较强的吸附力，而对蛋白质、多糖等的吸附力较小，并且核酸的构象不同，吸附力也不同，相对来说，超螺旋的DNA比线性、开环的DNA以及

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RNA的吸附力都要强。因此可以用羟基磷灰石对核酸进行分级分离并定量。

HPLC-HPHT法测定质粒的拷贝数只需将全细胞提取物上柱，在一定条件下洗脱，如图3，在两个小箭头之间，是在6 mol/L尿素-0.25 mol/L磷酸钠缓冲液(pH6.8)以0.45 ml/min流速的条件下洗脱下来的物质，包括染色体DNA、RNA以及蛋白质。经0.01 mol/L磷酸钠平衡后，在大箭头处开始梯度洗脱，条件是磷酸钠缓冲液在0.5ml/min流速下，浓度在2分钟内由0.01 mol/L上升为0.4 mol/L。大约13 min后，质粒被洗脱下来。因为质粒的浓度与质粒峰的面积成正比，根据已知浓度质粒的标准曲线，就可以确定该质粒的浓度。应用HPLC-HPHT法进行测定，质粒峰面积的误差为±15%［11］，质粒DNA的回收率为95%左右，并且在纯化的质粒中只残存有少于0.5%的染色体DNA［12］。一根HPHT柱大约可以分离200～400个样品。Genthner［11］用这种方法测定E.coli HB101中的pBR322拷贝数为29，与冷泉港实验室报道的30个相差不大。

图3 采用Bio-Gel HPHT柱分离质粒的洗脱图［11］

1.4 毛细管电泳（capillary electrophoresis, CE）

毛细管电泳是80年代后期在全世界范围内迅速发展起来的一种分离技术。毛细管电泳在肽、蛋白质（包括酶和抗体）、核苷酸的分离分析甚至快速序列测定方面都有巨大的潜力，而这种潜力又正好适应了各国在以生物工程、分子生物学等为代表的生命科学各个领域中对各种对象的分离分析和微量制备的迫切要求。90年代以后，在DNA的定量分析方面，CE技术已经成为一种极为有效的方法［13～15］。CE最大的优点是高效、快速、微量、自动化。

毛细管凝胶电泳（CGE）和毛细管无胶筛分电泳（NGS）常用来分离核酸，但凝胶毛细管柱制备困难，寿命短，且进样端易堵，所以无胶筛分电泳应用得更多一些。无胶筛分电泳就是在CE缓冲液中加入低粘度的线性聚合物溶液，如纤维素衍生物。这种线性聚合物可按分子

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大小分离组份，即起到了分子筛的作用。只是聚合物不象凝胶那样在柱内作交联反应，因此可以避免空泡的形成。无胶筛分电泳较便宜，简单，其功能可以通过改变线性聚合物的种类、浓度等予以调节，因此只要有一根简单的毛细管柱，即可作不同分子的分离。柱子的寿命长，制备简单，缺点是分离能力比凝胶柱略差。常用来分离核酸及其片段的是未交联的聚丙烯酰胺、甲基纤维素及其衍生物。

最初，CE分离核酸是用紫外吸收检测器测定260 nm处的光吸收值，90年后，Sunzeri等［16,17］将传统的荧光检测方法用在CE上来检测PCR产物。所使用的是非插入型的染料，如Hoechst 33258，这种方法检测的灵敏度与UV检测法相差不大［18］。后来又发展了采用激光诱导的荧光(laser induced fluorescence, LIF)来测定的方法，从而大大提高了敏感性。Schwartz和Uhfelder的工作表明，用LIF检测器的敏感性是UV检测器的400倍。用于LIF的荧光染料是YOYO、YO-PRO［19］或噻唑橙［14］等，这些染料属于插入型，可以被488nm的氩离子激光激发而产生荧光。其中，YOYO和噻唑橙不仅能染DNA，也能将RNA染色，因此若样品中污染有RNA时会影响测定结果。YO-PRO一般都与EB联合使用，加入EB后可以将低至12pg/μl的DNA染色。同时EB的加入并不会影响染色结果，因为EB产生的荧光不在探测范围内。根据质粒的浓度与峰面积/迁移时间的比率成正比即可确定测试质粒的浓度。毛细管电泳测定时，质粒的大小对于峰面积-迁移时间的比率影响不大，因此可用不同的质粒来作标准曲线。用毛细管电泳来进行定量分析的重复性非常好。同一样品质粒的峰面积-迁移时间的比率偏差范围(RSD)是0.5%～3.0%,而对同一浓度的不同样品来说，偏差较大为6.5%［19］。CE的测定范围很广，最低可检测浓度为5.4 μmol/L，最少量为0.08 pmol/L［15］

,线性范围的上限则因LIF检测器而受到限制［19］。 CE和HPLC一样，同是液相分离技术，它们遵循不同的分离机理，都有许多分离模式，因此在很大程度上二者可以互为补充，但是无论从效率、速度、样品用量和成本来说，毛细管电泳都显示了一定的优势。与HPLC相比，毛细管电泳的柱效更高一些，速度更快一些，同时，样品用量也比HPLC要少得多。CE没有泵运输系统，因此成本相对也要低一些。

2 杂交的方法

核酸杂交法是根据同源核酸序列可以配对的原理，人工制备出与特定片段有广泛顺序一致性的DNA或RNA探针，通过观察是否有DNA.DNA或DNA. RNA杂交分子的生成来检测特定基因的方法。

通常用来测定质粒拷贝数的杂交方法有Dot-blot和Southern-blot两种。Costanzi［20］等人对Dot-blot法测定质粒DNA和染色体DNA作了详尽的介绍，主要的步骤有：①裂解细胞；②抽提DNA；③点膜；④与特异探针杂交；⑤测定［21］。Southern-blot法主要步骤是抽提DNA，用特定的限制性内切酶作用以后进行凝胶电泳，然后将DNA条带转移到

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膜上，再杂交和测定。测定的方法主要也有两种，一种是液闪测定，另一种是放射自显影后扫描X光片［21］。在Dot-blot法中由于质粒DNA与染色体DNA都在同一个点上，因此应该采用两种探针，一种是特异地识别染色体DNA序列，另一种是特异地识别质粒DNA序列，这两种探针分别与完全相同的两张膜杂交，这样才能得到质粒DNA与染色体DNA的比值。而在Southern-blot法中，由于质粒DNA与染色体DNA已经得到分离，因此两种探针的杂交可以在一个体系中进行，或者采用一种既能识别染色体DNA序列又能识别质粒DNA序列的探针。杂交法最大的优点就是灵敏度高，可以检测到少至一个拷贝的基因，因此对于低拷贝数基因的检测来说，是非常有效的。

Guerrini［10］认为，DNA电泳条带在从凝胶向膜上转移的过程中会有一定程度的损失，影响定量的结果。可以省去转膜这一过程，而直接将凝胶干燥后进行杂交，但这种方法的灵敏度比转膜的方法要低一些。

比较这两种方法发现，对于环状的质粒来说，这两种方法得出的质粒拷贝数的结果是相同的，而对于线状的质粒来说，（比如

Borrelia中除含有一个27 kb的超螺旋闭环的质粒之外，还含有一个49 kb和一个16 kb的线状质粒），Southern的测定结果略高于Dot。这主要是由线状质粒的一个被称作“snap-back”的性质造成的。虽然DNA是在变性的条件下点膜的，但质粒也会发生“退火”的现象，从而影响了与探针的杂交，并且线状质粒越小，这种现象表现得越明显。

3 间接测定的方法

间接测定质粒拷贝数，即测定基因的剂量，不是象其它方法那样直接测定质粒的浓度，而是通过确定质粒所编码的某个基因产物的功能来反映质粒的含量。这种方法一般都是通过测定某个酶的活性来实现的，最常用的是测定β-内酰胺酶的活性。采用这种方法的前提是确证所分析的表现型与基因剂量之间是呈线性关系，并且这个基因定位在质粒上［9］。

β-内酰胺酶是Ampr基因的产物，青霉素在β-内酰胺酶的作用下可发生β-内酰胺化作用，青霉素转变为青霉酮酸。测定β-内酰胺酶活性的方法是由Lindstrom和Nordstrom于1972年建立的［22］，是在Novick的自动分析系统的基础上改进而来的。如图4所示，这个分析系统包括样品室、二元泵、比色计以及一个三点记录仪。一般以青霉素G作为底物，淀粉-I2为指示液，用在620 nm处吸收值的降低程度来测定酶的活性。一个单位的β-内酰胺酶是指在pH7.4和37℃时，每分钟能够水解1 umole青霉素G的酶量。这种方法一般用于质粒的突变检测，比如：E.coli K-12中的R1因子有多个拷贝数不同的突变体，用已知拷贝数的突变体作出一个与β-内酰胺酶相关的标准曲线，就可以测知未知突变株的质粒拷贝数［23］。类似的质粒还有：E.coli中的NR1，Serratia marcescens中的细菌素质粒，以及Enterobacter cloaceae中的Clo DF13等。测定酶活性的方法常由于产物动力学、代谢率和蛋白变性而

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易产生误差，并且影响酶活性的因素还有很多，酶活性与质粒拷贝数之间很少能得到一种线性关系［24］。

图4 自动分析系统进行酶活测定的流程图［22］

质粒的拷贝数通常有两种表示方法，一种是相当于每条染色体的质粒的个数，另一种是每个细胞中质粒的个数。由于在测定质粒拷贝数时最主要的一种系统误差来源于无法对细胞进行精确的计数，因此用前一种表示方法排除了这一因素的干扰。使用这种表示方法首先就假设了每条染色体在任何时候都对应着特定数目的质粒。但是大量的工作［25,26］表明,质粒拷贝数与染色体的复制是相互独立的，每个细胞中，质粒浓度与染色体DNA的浓度在不同的生长条件下都是不同的。因此相当于每条染色体的质粒的数目，只有在严格控制生长条件时，比较同一宿主细胞中不同质粒的拷贝数时使用，才有一定的可信度。而后一种表示方法中存在的最大的问题就是要准确地计数细胞，我们可以使用细胞计数仪来排除主观因素的干扰。另外,还要排除不含质粒的细胞的影响，这一点可以通过选择性培养基筛选的方法来实现［10］ 。 从以上叙述的方法中可以看出测定质粒拷贝数最大的问题就是要提高方法的精确度和可信性。其中提取DNA是一个很重要的环节，为了尽可能减少损失，一般都不用提纯质粒，只需提取总DNA即可。表1对以上各方法进行了简单的比较，可根据实际工作的需要选择合适的方法。

表1 测定质粒拷贝数方法的比较

方法CsCl-EB法凝胶电泳法HPLC法CE法

仪 器超速、液闪仪电泳仪、扫描仪色谱仪、HPHT柱毛细管电泳仪

试 剂*

CsCl、EB、同位素

EB无荧光染料

时 间**准确性24 h以上较差12～16 h较高40 min高30min高

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Dotminifold、液闪/扫描仪Southern电泳仪、液闪/扫描仪测酶活法自动分析系统同位素

同位素淀粉-碘液20 h48h以上10min较高较高差

* 试验中所用的主要试剂； ** 主要步骤所需时间 作者单位：军事医学科学院生物工程研究所 北京 100071

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(1998-12-08 收稿)

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