【实验目的】
通过实验验证分离规律、自由组合规律、伴性遗传和连锁互换规律，掌握果蝇杂交的实验技术和基因定位的三点测验方法，在实验中熟练运用生物统计的方法对实验数据进行分析。
【实验原理】
1. 果蝇（fruit fly）是双翅目（Diptera）昆虫，属果蝇属（genus Drosophila），约有3000多种，我国已发现800多种。大部分的物种以腐烂的水果或植物体为食，少部分则只取用真菌，树液或花粉为其食物。以果蝇作为遗传学研究的材料，利用突变株研究基因和性状之间的关系已近一百年，至今，各种研究遗传学的工具已达完善的地步，果蝇对今日的遗传学的发展有其不可磨灭的贡献；从1980年初，Drs. C. Nesslein-Volhard和E. Weichaus以果蝇作为发育生物学的模式动物，利用其完备的遗传研究工具来探讨基因是如何调控动物体胚胎的发育，也带动了其它模式生物（线虫、斑马鱼、小鼠和拟南芥等）的研究，且有非常具体的成果。
通常用作遗传学实验材料的是黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）。用果蝇作为实验材料有许多优点：
⑴饲养容易。在常温下，以玉米粉等作饲料就可以生长，繁殖。
⑵生长迅速。十天左右就可完成一个世代，每个受精的雌蝇可产卵400～500个，因此在短时间就可获得大量的子代，便于遗传学分析。
⑶染色体数少。只有4对。
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⑷唾腺染色体制作容易。横纹清晰，是细胞学观察的好材料。 ⑸突变性状多，而且多数是形态突变，便于观察。 果蝇的生活史：
果蝇的生活周期长短与温度有密切关系。一般来说，30℃以上温度能使果蝇不育或死亡，低温能使生活周期延长，生活力下降，饲养果蝇的最适温度为20～25℃。
生活周期长短与饲养温度的关系
卵→幼虫 57天 幼虫→成虫 18天 6天 4天 10℃ 15℃ 20℃ 8天 25℃ 5天 果蝇在25℃时，从卵到成蝇需10天左右，成虫可活26～33天。果蝇的生活史如下：
雌蝇 →减数分裂 → 卵
受精
雄蝇 →减数分裂 →精子
第一批成虫 羽化（第八天） （可活26～33天）
蛹（第四天）
产第一批卵
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第二次蜕皮 （第二天）
第一次蜕皮 幼虫 （第一天）
果蝇的生活周期和各发育阶段的经过时间
果蝇的性别及突变性状的鉴别：
果蝇的每一体细胞有8个染色体（2n=8），可配成4对，其中3对在雌雄果蝇中是一样的，称常染色体。另外一对称性染色体，在雌果蝇中是XX，在雄蝇中是XY。
果蝇的雌雄在幼虫期较难区别，但到了成虫期区别相当容易。雄性个体一般较雌性个体小，腹部环纹5条，腹尖色深，第一对脚的跗节前端表面有黑色鬃毛流，称性梳（Sex bs）。雌性环纹7条，腹尖色浅，无性梳。
实验中选用的果蝇突变性状一般都可用肉眼鉴定，例如红眼与白眼，正常翅与残翅等。而另一些性状可在解剖镜下鉴定，如焦刚毛与直刚毛等。现列表如下：
实验中使用的果蝇突变品系
影响部分 翅 眼色 体色 刚毛 突变名称 残翅 白眼 黑体 焦刚毛 基因符号 vg w b sn 染色体上座位 IIR 67.0 X 1.5 IIR 48.5 X 21.0
第一批卵孵化 （第零天）
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翅形 小翅 m X 36.1 焦刚毛的基因座为sn3, 本文简写为sn。
2.野生型果蝇为红眼、灰身、长翅、直刚毛，与这些性状对应的突变性状很多，其中灰身（+）与黑身（b）是一对相对性状，且灰身对黑身为完全显性，控制这对相对性状的基因位于第二号染色体上。用具有这对相对性状的两纯合亲本杂交，性状的遗传行为应符合分离定律。
3. 黑体果蝇的体色为黑色（b），与之相对应的野生型果蝇的体色为灰色（+），灰色对黑色为完全显性，控制这对相对性状的基因位于第二号染色体上；果蝇另一突变性状为焦刚毛（sn），与之对应的野生型性状为直刚毛（+），控制这对相对性状的基因位于第一号染色体上，直刚毛对焦刚毛为完全显性。用具有这两对相对性状的纯合亲本杂交，其性状的遗传行为应符合自由组合定律。
4. 生物某些性状的遗传常与性别联系在一起，这种现象称为伴性遗传（sex-linked inheritance），这是由于支配某些性状的基因位于性染色体上。果蝇属XY型生物，共有四对染色体，第一对为性染色体，其余三对为常染色体。雌果蝇的性染色体构型为XX，、雄果蝇为XY。控制果蝇眼色的基因位于X染色体上，在Y染色体则没有与之相应的等位基因。将红眼（+）果蝇和白眼（w）果蝇杂交，其后代眼色的表现与性别有关。而且，正反交的结果不同。
5. 不完全连锁基因在形成配子时，随同源染色体非姊妹染色体单体之间发生交换而交换，产生一定频度的重组型配子，在子代中表现一定比例的重组性状，通过观察和统计测交子代各种表型的个体数，可估算出连锁基因间的交换率，由此确定基因在染色体上的相对位置，绘制出连锁遗传图。已知果蝇（Drosophila melanogaster）的红眼（+）对白眼（w）是显性，直刚毛（+）对焦刚毛（sn）是显性，长翅（+）对小型翅（m）是显性，控制这三对相对性状的基因都位于X染色体上，若将白眼（w）、焦刚毛（sn）、小型翅（m）三隐性突变体雌蝇（Xw sn mw sn m
X）与红眼（+）、直刚毛（+）、长翅（+）野生型雄蝇（X+++Y）杂交，则F1可产生三杂合体雌蝇（Xw sn mX+++）和三隐性雄蝇（Xw sn mY）。由于Y染色体上不携带相应的等位基因，因而表现出X染色体上三个隐性基因所控制的性状，相当于一个三隐性纯合体。用F1代杂交（相当于测交）,F2代表现出的8种表型及数目与F1雌蝇产生的8种配子及数目一致，通过观察和统计F2代（相当于测交子代）8种表型的个体数，就可估算出这三对基因间的交换率，由此确定这三对基因其在染色体上的相对位置，绘制出连锁遗传图。
【实验材料】
不同品系的黑腹果蝇； 黑身果蝇（b）：黑体、红眼、长翅、直刚毛（bb ++ ++ ++）品系； 三隐果蝇：灰体、白眼、小翅、焦刚毛（++ ww snsn mm）品系。 实验用具、药品：
双筒解剖镜，镊子，解剖针，毛笔，白瓷板，吸水纸，培养箱，饲养瓶（指
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管），麻醉瓶，棉花，乙醚，酒精，丙酸，培养基等。
【实验操作】
（一）果蝇实验技术
1. 麻醉：对果蝇进行检查时，用乙醚麻醉，使果蝇处于昏迷状态。使用时将乙醚（2～3滴）滴到麻醉瓶的棉花球上（注意不要让乙醚流进瓶），麻醉瓶要保持干燥，否则会粘住果蝇翅膀，影响观察。麻醉果蝇时，先将长有果蝇的培养瓶在海棉垫上敲，使果蝇全部震落在培养瓶底部，然后迅速打开培养瓶的棉塞，把果蝇倒入去盖的麻醉瓶中，并立即盖好麻醉瓶，待果蝇全部昏迷后，倒在白瓷板上进行观察。
果蝇的麻醉程度看实验要求而定，对仍需培养的果蝇，以轻度麻醉为宜。但对不再培养，单单进行性状观察的果蝇可以深度麻醉，甚至致死也无妨（果蝇翅膀外展45角，说明死亡）。检查完毕后，把不需要的果蝇倒入盛有煤油或酒精或水的瓶中（死蝇盛留器）。
2. 果蝇交配：将雌雄果蝇放在一起培养，雌蝇的生殖器中有贮精囊，可保留交配所得的大量精子，雌蝇一次交配所得的精子，足够它多次排出的卵受精，因此在做杂交试验时，雌蝇必须选用处女蝇（没有交配过的雌蝇）。雌蝇孵出后12小时不会交配，这个时间把果蝇全部倒出，分出雌雄蝇，单独饲养，这时收集的雌蝇是处女蝇。杂交时把所需品系的雄蝇直接放到处女蝇培养瓶中，贴好标签，注明两亲本的基因型及交配日期，进行培养。7～8天后倒掉亲本（一定要倒干净，以免亲代和子代混淆），待F1成蝇羽化后开始计算，观察性状。可靠的计数及观察是培养开始的20天以（再晚F2也可能有了）。若须继续实验，观察F2，可在F1挑出雌雄数对，另外培养，因为这次是用F1作亲本，进行个体间互
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交，所以这时不是处女蝇也可以。但如要把F1雌蝇与另一品系雄蝇杂交时，还要严格地选取处女蝇，方法同上。
3. 原种培养
在作新的留种培养时，应事先检查一下果蝇有没有混杂，以防原种丢失。亲本的数目一般每瓶5～10对，移入新瓶时，须将培养瓶横卧，然后用毛笔将麻醉的果蝇从白瓷板上轻轻扫入，待果蝇醒过来后再把培养瓶竖起，以防果蝇粘在饲料上。原种每2～4周换一次培养基（依温度而定，10～15℃约4周换一次，20～25℃约二周换一次）。每一原种培养至少保留两套，培养瓶的标签上要写明突变名称，培养日期等。作原种培养温度可控制在10～15℃，培养时避免日光直射。
果蝇在适宜条件下会产子代，在肉眼能看到幼虫时就可把亲本倒掉，几天以后，新的成蝇便产生。待成蝇有了足够保种的数量后，要调换培养瓶，作为下一代的亲本，继续培养。
原种果蝇培养遇到的麻烦是饲料发霉。发霉的原因很多，如用具没有灭菌，空气污染，亲本不及时倒掉，都会引起饲料发霉。严重的霉菌污染会影响果蝇的生长。饲料中加丙酸可以抑制霉菌，但并不能完全制止。发现培养瓶中有少量霉点时可用烧过的解剖针挑出。若大量霉菌污染，可把果蝇全部倒在一个消毒过的空指管中，让它活动2～3小时，换一支指管，再活动1～2小时，而后倒入一支新的培养瓶中继续培养，这样可以防止霉菌污染。
原种保存遇到的另一个问题是混杂，几个不同品系的果蝇在一起培养，一定要防止混杂。培养瓶的塞子要做得紧些，不使果蝇逃出。调换培养瓶时，要防止果蝇飞散。外逃的果蝇要打死。发现了混杂的原种，要根据原种果蝇的全部特征，挑出数对雌雄蝇饲养，进行筛选直到完全没有分离为止。这样做，费时费力，只
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是在不得已时才采用。一般混杂时，只要方便，可以重新引种，将混杂种弃去。
（二）果蝇杂交实验
（1）果蝇的性状观察、性别鉴定及饲养。
（2）选取杂交亲本中所用的母本必须是处女蝇。刚羽化的雌蝇在12h一般无交配能力。在杂交前放出亲本培养瓶中的所有成蝇，每隔10～12h收集一次羽化的成蝇，并将雌雄蝇分开饲养。收集处女蝇数量的多少根据需要而定。
（3）麻醉接种 用黑身果蝇与三隐果蝇杂交，正反交同时进行。即三隐♀×黑身♂，黑身♀×三隐♂。
将所选处女蝇按品系分别麻醉，按不同杂交组合分别选取雌、雄蝇各6～10只移入杂交瓶中，为了防止昏迷果蝇被培养基粘住，可将培养瓶放倒，将果蝇置于瓶壁，待其醒后再将培养瓶直立，贴上标签：
正交 反交
w-m-snw-m-sn+++++++++w-m-sn
♀BBXXbbXY♂ ♀bb X X BBXY♂
日期： 日期： XX： XX：
将杂交瓶放在20℃～25℃恒温箱培养。
（4）培养7～8d，倒掉杂交亲本（倒掉的果蝇最好处死）。
（5）再过4～5d，F1代成蝇出现，观察F1代性状是否和预期结果一致。 （6）收集6～10对F1代果蝇放入一新培养瓶，在20℃～25℃恒温箱继续培养，以便观察F2代（正反交作相同处理）。 （7）继续培养7～8d后，移去F1代。
（8）再4～5d，F2代成蝇出现，开始观察并统计F2代的性状表现类型及数目。
【结果统计分析】
（一）数据记录 灰体 正交 ♀ 红、长、直╋╋╋ 白、小、焦━━━ 白、长、直━╋╋ 红、小、焦╋━━ ♂ ♀ ♂ 426 362 77 96 3856 3098 760 718 黑体 合计 1622 1247 561 1185 1154 397 309 264 261 259 113 99 ..
红、长、焦╋╋━ 白、小、直━━╋ 红、小、直╋━╋ 白、长、焦━╋━ 体色合计 性别合计 性别合计
63 81 311 341 49 97 315 245 22 26 127 131 17 36 128 75 151 240 881 792 7803 2693 4176 3627 1476 1217 10496 ♀ 5652 ♂ 4844 灰体 反交 ♀ 红、长、直╋╋╋ 白、小、焦━━━ 白、长、直━╋╋ 红、小、焦╋━━ 红、长、焦╋╋━ 白、小、直━━╋ 红、小、直╋━╋ 白、长、焦━╋━ 体色合计 性别合计 性别合计
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黑体 合计 ♀ ♂ 481 313 74 62 41 35 125 77 6629 1494 352 356 201 133 696 438 ♂ 3558 1437 1153 145 46 73 41 13 157 61 914 205 195 88 73 318 274 122 27 26 31 12 96 26 7598 2701 10299 4094 3504 1493 1208 ♀ 5587 ♂ 4712 （二）统计分析 1.分离定律 图谱分析
P: BB（灰体）×bb（黑体）
F1: Bb(灰体)
自交
F2： BBBbbb
灰体 黑体
理论 比值：3 ： 1
实际 正交数量： 7803 2693 比值：2.90 ： 1 反交数量：75982701
比值： 2.81 ： 1
χ2检验 基因 F2表型 实得数O 正交 预期数E χ2 P（n=1） 基因 表型 实得数 反交 预期数 χ2 P（n=1） ..
体色基因（B/b） 灰体 7803 7872 黑体 2693 2624 2.4192 0.10—0.50(>0.05)（差异不显著） 体色基因（A/a） 灰体 7598 7724.25 黑体 2701 2574.75 8.2540 <0.01（差异极显著） 合计 10299 10299 合计 10496 10496 2.自由组合定律 图谱分析 正交：
P: 灰体焦刚毛（BBXsnXsn）× 黑体直刚毛（bbX+Y）
F1: BbX+Xsn×BbXsnY
F2： BBX+XsnBbX+XsnBBXsnXsnBbXsnXsnbbX+XsnbbXsnXsn
BbX+Y BBX+Y BBXsnY BbXsnYbbX+YbbXsnY
灰体直刚毛 黑体直刚毛灰体焦刚毛黑体焦刚毛 理论比值：3 ： 1 ： 3 ：1 实际数量：4243 14943560 1199
比值： 3.54 ： 1.25 ： 2.97 ： 1
反交：
P: 黑体直刚毛（bbX+X+）×灰体焦刚毛（BBXsnY）
F1: BbX+Xsn ×BbX+Y
+++++sn+sn+sn++
F2： BBXXBbXXBBXXBbXXbbXXbbXX
BbX+Y BBX+YBBXsnY BbXsnY bbX+YbbXsnY
灰体直刚毛 黑体直刚毛 灰体焦刚毛 黑体焦刚毛
理论 比值： 9 ： 3 ： 3 ： 1 实际 数量： 580720031791698
比值： 8.32 ： 2.87 ： 2.57 ： 1
χ2检验 表型 合计 正交 实得数 预期数 χ2 P（n=3） 灰体直刚毛 4243 3936 黑体直刚毛 1494 1312 灰体焦刚毛 3560 3936 94.8463 <0.01（差异极显著） 黑体焦刚毛 1199 1312 10496 10496 ..
实得数 反交 预期数 χ2 P(n=3) 3.伴性遗传 图谱分析
5807 5793.1875 2003 1931.0625 1791 1931.0625 17.4544 698 643.6875 10299 10299 <0.01（差异极显著） 正交 反交
P：XwXw（雌白眼）×X+Y（雄红眼） X+X+（雌红眼）×XwY（雄白眼）
F1: X+Xw（雌红眼）× XwY（雄白眼） X+Xw（雌红眼）× X+Y（雄红眼） 理论：1 ： 1 1 ： 1
实际： 25 ： 16 30 ： 29
F2：X+XwXwXwX+YXwY X+X+X+XwX+Y XwY
雌红眼 雌白眼 雄红眼 雄白眼 雌红眼雄红眼雄白眼
理论 1 ： 1 ： 1 ： 1 2 ： 1 ： 1 实际 3069：2583 ：2537 ：23075135 ： 2747 ： 1965
χ2检验 表型 实得数 F1 正χ2 交 P（n=1） 表型 F2 实得数 3069 2537 2583 2307 10496 雌 0.1—0.5(>0.05)（差异不显著） 雄 雌 雄 合计 1.9756 预期数 雌 25 20.5 红眼 雄 0 0 雌 0 0 白眼 合计 雄 16 20.5 41 41 ..
预期数 χ2 P(n=3) 表型 实得数 F1 预期数 χ2 反交 P（n=1） 表型 实得数 预期数 F2 χ2 P（n=2） 4.连锁交换定律
2624 2624 2624 117.2880 2624 10496 <0.01（差异极显著） 雌 30 29.5 雄 29 29.5 雌 0 0 0.0169 0.5—0.95(>0.05)（差异不显著） 雌 5135 4923.5 雄 2747 2461.75 雌 - - 142.3761 <0.01（差异极显著） 雄 1965 2461.75 合计 9847 9847 雄 0 0 合计 59 59 利用正交数据进行统计可知，表型+ + sn和w m +个体数目最少，应是双交换产物，由此可以推论，基因sn一定位于中间，而三基因的相对顺序是w sn m
三点测交结果统计 F2表型 + + + w sn m + + m 数量 3856 66.25％ 3098 881 15.94％ √ √ 比例 重组发生在基因 w—sn sn—m w—m ..
w sn + + sn m w + + + sn + w + m 总计 染体
w-m sn-m w-sn 并发率 干扰 792 718 14.08％ 760 151 3.73％ 240 10496 1 交换值 30.02％+2×3.73％＝37.47％ 19.66％ 17.81％ 1.07 -0.07 17.81％ 19.66％ 图距 37.47 19.66 17.81 30.02％ 理论值 34.6 15.1 19.5 色图
√ √ √ √ w sn m
17.8119.66
33.4
理论连锁图
w sn m
15.10 19.60
34.60
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【分析及讨论】
1.分离定律的验证：果蝇的体色是一对独立遗传的常染色体基因。对于这对基因来说，自身遵守分离定律，且正反交表型比率相同。但是针对实验得到表型比率来看，相差比较大。单因子适合度测验主要是来验证分离定律。在χ2适合度检验中我们发现，正交的结果P值>0.05，说明实验得到的数据与理论的数据相差不大，支持最初的假设。但是对于反交来说，得到的P值<0.01，说明与孟德尔分离定律相差很大，不能够用基因的回交来说明。
2.自由组合定律的验证：果蝇的体色和刚毛是两对独立遗传的基因，刚毛基因位于X染色体上。因此，对于这两对基因来说，自身遵守自由组合定律，且F2正反交表型比率不同，通过图谱分析，我们得到正交表型比率（灰体直刚毛：
2
灰体焦刚毛：黑体直刚毛：黑体焦刚毛）分别为3:3:1:1和9:3:3:1。在双因子χ适合度检验中，正反交的结果P值均<0.01，与孟德尔自由组合定律相差很大。
针对于以上单因子及双因子χ2适合度检验发生的现象，我认为主要有以下两个方面的原因：
1）选取的实验方案本身存在问题。这两对基因并不是完全独立遗传，由反交型的单因子适合度测验可以看出，体色分离比不符合3:1，可能两个基因存在于某些有关于性别方面的连锁。
2）实验的随机误差较大。实验操作的不到位以及对果蝇性别、表型特征分辨错误使结果出现误差。
3.伴性遗传规律：果蝇的眼色是由X染色体控制的遗传性状，其基因仅位于果蝇的X染色体上。对于这对基因来说，遵守伴性遗传的规律，且正反交个体在F1、F2代上表型比率不同，通过图谱分析，正交个体在F1代产生的雄性个体都是白眼的。 通过χ2适合度测验，正反交的结果F1代P值均>0.05，符合伴性遗传规律，而F2代P值均<0.01，不符合伴性遗传规律。分析原因主要是：
1）在伴性遗传中，眼色基因并不是独立进行遗传，其会与X染色体上其他基因发生连锁交换，从而产生表型性状不符合理论比率的情况，甚至在F2代会出现白眼雌蝇的性状（按照遗传图谱分析，F2代不会出现该性状）。
2）实验的随机误差较大。实验操作的不到位以及对果蝇性别、表型特征分辨错误使结果出现误差。
4.连锁交换定律的验证：
由以上分析数据可以看出，本组实验结果与理论值较为接近，尤其是sn—m基因间的图距。产生数据偏差的原因可能是进行实验的环境条件有差异，我们知道不同环境条件下的重组值是有变化的。而且进行三点测交实验数据越多越精确，实验室中果蝇数目有限这就使偶然因素引起的误差的影响力加大，也是导致结果与理论值有偏差的原因之一。加之三隐性个体的生存力很弱，在幼虫密度较高时易在自然选择中被淘汰，在实验中此因素也有可能引起误差。而且观察果蝇时，有一些观察不到放走的，死掉的或者没有观察清楚的等等。但是虽然定量结果存在一定偏差，但是此实验还是可以准确地反映三个基因的连锁位置关系。根据本组实验数据计算出的并发率近似等于1，距此可判断此三个基因间不存在干扰。
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