贴壁细胞的脂质体转染protocol

1、宿主细胞CHO（贴壁细胞）

2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000（invitrogen公司） 3、6孔细胞培养版

4、无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO） 5、转染级质粒

二、实验步骤

invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔......板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧！

1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。（我的接种密度是3~4*105/ml.）转染时，细胞要达到90~95%的融合。

2、溶液1：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well （总体积250 ul）（温育5min）

3、溶液2：X ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well（总体积250 ul）

4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。

5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。

6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5％的CO2中保温5~6小时。

7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％的CO2中48~72h检测转染水平。

8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例（根据细胞的生长情况）接种到新的培养板，加抗生素进行筛选。

三、个人经验：

我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。转染率很高。以下是个人经验，与大家分享。

1.细胞的状态。这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。有文献说传代不要超过17代。我总是在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。

2.细胞的融合度。细胞的融合度必须要达到90%才能做，细胞太少，容易死的。

3.无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO）很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍（我曾比较过OPTI-MEM与PBS或无血清的DMEM，前者的转染效率确实高）。注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。

4.加入无血清培养基后5~6小时更换全培养基。无血清培养基培养时间过长，对细胞是有毒性的，这里有血的教训！

5.转染的质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素。浓度不要低于0.35ug/ul。低浓度的质粒，我做的结果都不好。

6.48小时mRNA表达最高；72h蛋白表达最高。

细胞转染技术简介

转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。

理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。

本公司生产的高效转染试剂VigoFect，是一种以阳离子非脂性物质为主的配方组分，该类物质介导的细胞转染，是目前非病毒转染方法中转染效率最高的方法。VigoFect使用方便，转染效率高，对细胞毒性小，并有广谱的转染特性。在许多实验室长期使用，获得了优异的效果。一些实验室用VigoFect进行SiRNA的转染，也获得满意的结果。

需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。

细胞传代

(1) 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌)，酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。

(2) 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。

(3) 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟(37。C，5%CO2 )。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。

(4) 加入1ml的含血清培养基终止反应。 (5) 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 (6) 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。

(7) 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。 (8) 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 (9) 将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。 细胞转染

1)转染试剂的准备

A. 将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 B.震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡，。

2) 选择合适的混合比例(1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。

5) 将混合液在室温放置10—15分钟。

6) 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 7) 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。

8) 到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。

第二次细胞传代

1) 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。

2) 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新粉入培养皿中。 3) 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。一些传统的转染技术，如DEAE右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理及应用特点见下表：

转染方法 原理 应用 特点

不适用于原代细胞

磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞

磷酸钙法

内吞

稳定转染

操作简便但重复性差

瞬时性转染

有些细胞不适用

带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电

DEAE-右旋

的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细

糖苷法

胞内吞

稳定转染

高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA通过

电穿孔法

膜上形成的小孔导入

所有细胞

通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染

病毒介导法

色体中

稳定转染 瞬时性转染 瞬时性转染

相对简便、结果可重复 但对细胞有一定的毒副作用 转染时需除血清

适用性广但细胞致死率高，DNA和细胞用量大， 需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件

可用于难转染的细胞、原代细胞，体内细胞等

但携带基因不能太大细胞需处分

逆转录病毒 特定宿主细胞 裂期

需考虑安全因素

通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染

腺病毒

色体中

瞬时转染 可用于难转染的细胞

特定宿主细胞 需考虑安全因素 稳定转染

适用性广，转染效率高，重复性好，但转染时需除血清。转染效果随细胞类型变化大

阳离子脂质带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基

瞬时性转染

体法

团形成复合物被细胞内吞

所有细胞

将DNA用显微重金属颗粒沉淀，再将包

Biolistic颗

被好的颗粒用弹道装置投射入细胞，

粒传递法

DNA在胞内逐步释放，表达

转染细胞数有限

稳定转染

显微注射法 用显微操作将DNA直接注入靶细胞核

瞬时性转染

胚胎细胞

多用于工程改造或转基因动物的

瞬时性转染

胞，淋巴细胞系以及原代细胞 可用于：人的表皮细胞，纤维原细

;除上述传统方法外，近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效率高受到研究者们的青睐。其中树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。大量实验证明，PEI是非常有希望的基因治疗载体。目前在设计更复杂的基因载体时，PEI经常做为核心组成成分。

线型PEI（Line PEI,LPEI）与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI（Branched PEI,BPEI）要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低，有利于细胞定位，因此与BPEI相比应该转染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI的毒性低，但转染效率却较高。

GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其具有较高的正电性，因此易于高效地包裹各种DNA、RNA分子及质粒形成小的纳米颗粒，从而提高转染效率，当所形成复合物进入细胞以后，其中所含的生理条件下可降解的化学键在细胞内水解，使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI，这样结构的转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性，其可降解性对体内应用也具有重要的意义。