壳聚糖季铵盐作为基因递送载体的初步研究

中国组织工程研究与临床康复Journa第73眷第72甥ssue2009esearc03h19rc出版，lofClinicalRehabilitative~EngineenngRMah792009V0113．，No12爱7乏泛基础实验壳聚糖季铵盐作为基因递送载体的初步研究冰冰★钟婧a，何卓晶rnary，陶薇，洪艳msaQuZhoteammoniultofchitosananasagenedeliveyrvectorngJingc，HeZhuojing，laoWeiHo，ngrAbstratnrsne—BACKGROUND：NomoreviralvevectorshaenvewonwaideQspreadteconcernowingtoitssaltosacfetyinthefieldnasanewonon—viralvectohabeinvestigteduarnaryammOniumfhitosafgenetherapyandmoreabiologicalmaterialalsohas．ndBloengIneermgInAstitute．Zhejiaongaupotentialofbeingge0BJECTIVE：Toinvvectorsesdeliveyrvectortigatetheinvitrotra：Aconcademy，fMed~cn)nsfectionactivityofquaternaryammoniumsaltofchitosanandtosearchnewnon—viraScienceHagzhon310013Prov，Zhejia．gdeliveyrDESIGNTIMEANDSETTINGing，eneinceChinatrastobservationalstudyerwas．performedintheBioenginee—ngInstituteofZhejiaangZhonAcadyMATERIALS3emofMedicaIS：pccience一betweensmAprilanscdDetorecemab2008gJing★．2hydronanopa~iclevectorMETHODS：Abilitychloro一DNA31EGFPpiaxypropyttrimethylawasoidwasdtBiowasengineeringLaboratoyrkequateidofZh~iangAcadesamoyfcofMedicn．lScienceStudyingformastersdegBIOereen．mmoniumhlorideusedto．marnaryammOniumlthitosaandgIneerIn。glmauadernausingdoubleammOniumnucleasecoace~asationmethodInstituteraafq一teyrltofchitosnantowevapplasmwasanalyzedusingge，lretardationtesntTheacabilityoAcadeSmZhejiangyofMedicauloprotenanoctpcDNA31EGFPfromwasdegexrradatiowaslutedusingDNaseJprotectiontestthetransfectiotivitytofcience，．Hangzho310013PzZhejia．ngpa~iclesassessecdbytratryciencnsfectionoperimnentinvitro．ansdthelastttransfeancresultswereeva，luatedbyinvresearcersesdfluorescencerovinceChinamwicroscorpeandflownsytonemeInthetheahadto，seevkthebeinetionconditionthishalso，houldficndouhongjingl03com@hetheuathetrafectioifywasfectedwithbotigaserumdtheaamountofpcDNAAdditionallythehitosaanytotoxicityfyahoocnqternaryammOniumsaltofchito：WsanwasinvcomesteduingMTTassnray．CoammOn．rresnpondenceto：MAINOUTCOMEMEASURESfoformthecausenanoshatthebinatiowasteofquaternayrllsiumsaltofcndpcDNA31EGFP一．wasHoang、，spa~iclesttrans．whetheearbovineserumfound{ntrakidnensfectionfluid．wwhatthebestconcentrationsaothehighe。fectionuiffciencecyoofhuomanemcebryoyTceandho．quaternaryammOniumfplasmidltofchitoswastotInveBtigator．ana10engl兀eerIn．gndiferentcOncentratiOnsco：Qualdtgsarowthc，fllsweredetectedinthisoustudyfecInstituteAcaZhejiaogdemy，fMedicanRESULrSsetemaryrammoniumltfhitosannanonsignificantlyweanckethanpolyethyleneimineammOniumwaswasbutthetrapaniclescfectionefipa~icleslt，ldtraynsthumanembryokidneyTncellsinean．dthetoxicitywasScience，Hagzhouciencwasabitloawererthaperslyethyle．nimThetransfeeanaanction310013ZhejiangwfficieyofquaternarysaltofchitosannanoreacthetraamounnstofpcDNAn2Pginfectiopllsrocedurequaternaryammoniumtheabsenceofbovinese．sarumofchitosanshedthepeaknandpcDNActf72houocmByacomprehensivralysis．henProvince．Chinawerebinedinthe．masstioof5dtheSuthetrafetioneifciencerywasthehighestsomeNatuppoSedby：theraIScienceunCONCLUSIONinthesece．：QuatemaryammoniumresallofchJtosansananopa~iclesdcanasdelivgeneenecocewllsandthegenecanrsbeexpressedFodationnofinc‘Thefore．quaternayrammOniumltofchitosanusevectorsingdeliveryillbewoRhfu~hetudyingZhejiaNoPnrojecgPrrove．Y2080761tfotio：ZhongJy。HeZJ，TaoW．HongYQuateYanjiuuLinchuangKangfu．yammoniumr13(12)：237323772009；rna—saltofchitosanasage．new／／[http：wwcrtercndeliveyrhttp：／／envecztorZhonggocmuoZuzhiGongchegCoconsntrucnoflglckf】ZhejiagProvinciaHealthBw—ureau．Ne’~20082016ce摘要背景：Reived=2009-01_09非病毒载体因其安全性好而在基因治疗领域赢得了广泛的关注一，各种各样的非病毒载体处在不断的研究中，壳聚糖Accepted：20090212季铵盐作为设计种新的生物材料，同样也具有作为基因递送载体的潜质，。目的：考察壳聚糖季铵盐体外基因转染活性、寻求一种新的非病毒基因载体递送系统以3氯。时间及单位：对比观察实验质粒pcDNA31EGFP．．，于200804／12在浙江省医学科学院生物工程所完成。材料：为浙江省医学科学院生物工程实验室保存。。2羟丙基三甲基氯化铵作为改性剂制备壳聚糖季铵盐，用复凝聚法制备载基因纳米粒方法：凝胶阻滞实验分析壳聚糖季铵盐包裹质粒的能力，DNaseI的保护实验分析载基因纳米粒的抵抗核酸酶降解的能力。，体外基因转染实验评价纳米粒的体外转染活性的细胞毒性，用倒置荧光显微镜观察和流式细胞仪测定转染结果，通过考察转染液中有无牛血清和递送不同剂量的基因对转染效率的影响。寻求本递送系统较好的转染条件。另外，用MTT法测定壳聚糖季铵盐质粒的量为多少主要观察指标：壳聚糖季铵盐和pcDNA31EGFP以何种比例结合形成的纳米粒．．、转染液中有无牛血清。，时对人胚肾T细胞的转染效率是最高的；不同浓度的壳聚糖季铵盐对细胞生长的影响结果为5：壳聚糖季铵盐纳米粒能转入人胚肾72hT细胞，，虽然转染效率略逊于聚乙烯亚胺，，但是细胞毒性明显小于聚乙烯亚胺g，。壳聚糖季铵盐纳米粒转染细胞后效率较高经综合分析当pcDNA质量为2，“壳聚糖季铵盐和pcDNA以质量比。结合形成的纳米粒：，在无血清条件F对人胚肾T细胞进行转染，转染效率是最高的。结论壳聚糖季铵盐纳米粒能将基因递送到细胞内并且报告基因能在细胞内表达因此，壳聚糖季铵盐用做基因递送的载体系统值得进关键词．步的研究。：壳聚糖季铵盐；基因治疗；基因载体．doi：103969／jissn．16738225200912040—．．．钟婧，何卓晶2373)：，陶薇．，洪艳壳聚糖季铵盐作为基因递送载体的初步研究[J]中国组织工程研究与临床康复．．，200913(122377ww／／[http：w．crterorg．http：／／cn．zglckf．com】|SsN16738225．CN2115397R—coDEN：zLKHAH23732死疋浙江省医学科学院生物工程所浙江省杭州市，w眦CRTER0rg．钟嫡．等壳聚糖季铵盐作为基因递送载体的初步研究方法0：“：310013引言3”氯2羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的制备女婧★1983年生浙江汉省湖州市人族浙江省医学科学院在读硕士主要从事壳聚糖方面的研究zhongjingl03@钟将壳聚糖季铵盐直接溶于5基因治疗主要是通过有效的基因传递系统mmol／L的Na2S04，，，中，调整浓度至02g／L．．．。，，，将质粒DNA(plasmidDNApDNA)导入到目的细胞中进行转录和表达并最终将携带的基因，，J~lJ备：采用碱裂解法质粒pcDNA31EGFPI)~制备，j~pcDNA31EGFP质粒溶于5一．mmol／L。信息传递给所连接的细胞中疗的目的。，从而达到基因治的Na2S04中，L调整浓度至01g／．一一。yahoo．com．cn壳聚糖是提取白海洋甲壳类生物的，壳聚糖季铵盐pcDNA31EGFP~ItJ米粒制备：．通讯作者：洪艳研究员浙江省医学科学院生物工程所，。天然高分子多聚糖它做为新兴的生物资源，、，具将壳聚糖季铵1，：U~pcDNA分别按质量比为2，：有许多独特的优良性能如抗菌性生物可降解，5：1m，10：120：1混合¨圳。，在室温下静置性、安全无毒性、生物相容性、细胞黏附性等”【，浙江省自然基金目‘Y7612080浙()江省卫生厅省部目共建项0(wki2082——30in，即纳米粒形成项因而很适合作为基因递送的载体更重要的。一是它能保护DNA免受DNase的降解怔J凝胶阻滞试验：取不同质量比的壳聚糖季铵将壳聚糖季铵化是提高壳聚糖水溶性的种方法，盐pcDNA31EGFP~米粒溶液一．，1％琼脂糖凝一016、’只有质子化可溶性壳聚糖才使细胞膜形胶电泳DNa一，分析结果。seR318中图分类号：B文献标识码：16738225文章编号：(2009)1243237305成短暂的通道提高基因跨膜运输效率3氯2，。I保护试验一．：取不同质量比的壳聚糖季~J米粒溶液．羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(QC)就是其中一种季铵盐，它能在任何pH条件下溶解p由，且溶解效果铵盐pcDNA3的DNaseI，1EGFP，加入05U．37℃水浴O5一．h。同时以未加，还比较好J，这样首先就解决了壳聚糖在生理条。DNasel的pcDNA31EGFP。作对照10g／L琼件下不溶的问题应更强瞄吲。壳聚糖季铵化在，一定程度上增脂糖凝胶电泳分析结果强了壳聚糖的正电性因而形成纳米粒的能力也100。293T细胞的基因转染：将细胞接种于含体积100所以本实验对壳聚糖所做的改性优化，分数为10％的小牛血清37℃、U／mL青霉素，、了壳聚糖的水溶性目前，提高了壳聚糖的正电性mL链霉素的高糖DMEM培养液中U／，在。国外有研究学者用NNN三甲基氯，体积分数为0将细胞按2．05的C02培养箱中培养传代：，化铵壳聚糖作为基因载体进行研究的报道p而且达到了不错的效果。。’…，壳聚糖季铵盐毒性检测(MTT)收集对数期7L板中，实验拟通过3氯一一2羟．细胞，×10，孔接种在96，4丙基三甲基氯化铵壳聚糖制备载基因纳米粒通，孵育至80％到90％融合后浓度分别为018．加入用无血清培u．过考察纳米粒的稳定性转染效率和细胞毒性筛、养基稀释的壳聚糖季铵盐溶液100，L，，质量．选出进…一种可以用于基因治疗的基因递送载体为，。024．，032．，042、056，步的体内应用研究奠定基础材料和方法设计：对比观察实验0_75，1g／L，另设细胞空白对照孔，聚乙烯亚胺阳性对照孔1每孔设5复孔。主要观察指标：考察转染液中有无牛血清对转染的影响和在相同质量比的前提下。，不同的质粒量对转染的影响。荧光显微镜下观，12在浙江省时间及单位：实验于200804／察细胞状态和细胞转染状况别收起570nm，之后将细胞分。医学科学院生物工程所完成一。用流式细胞仪检测转染效率。以材料：质粒pcDNA31EGFP为浙江省医学科学院生物工程实验室保存其他常规试剂均为．为检测波长测定吸光度、。设计实施、、评估者：设计为第三作者，一作者，国产分析纯主要试剂、。实施为第来源二、评估为通讯作者。，仪器所有作者均受过相关正规培训统计学方法：由第一作者运用SPSS130软．壳聚糖3氯2羟丙基三甲基氯化铵(CTA)DNA小提试剂盒青岛利中甲壳质有限公司陕西大生有限公司广州东盛生物科技有限公司日本Takara公司美国Sigma公司件进行Inde据以x±S结果，pendentSampleTTest分析，实验数。以P<005．为差异有显著性意义DnaseI、聚乙烯亚胺(M25000)M1_r2人胚肾T细胞(293T)高糖DMEM培养基小牛血清中科院上海细胞所美国Gibco公司杭州四季青生物工程材料有限公司21．壳聚糖季铵盐结构式一在一定的条件下向壳聚糖分子中引入2羟丙基三甲基氯化铵基Po．2374Box1200Shenyang110004cnzglckfcom钟婊．等壳壤糖季铵枯作为基因逮送载体的幸刃步研究．2死2表1Table1oWWW．CRTER舢团而得到壳聚糖季铵盐，见图1。不同壳聚糖李钱盐浓度作用后的A位AbsorbanceaternafqufollowinginductionryammoniumsaltofAbsocfdifferehitosanbancentconcentrations(又±s(570nm)ConcentrationL)(g／or)018．024032．042056．0_75100O1ControIL~U0其中024g／，．．75g／L这两个质量浓度分别与它们的上后，一个质量浓度相比对细胞的毒性影响有极显著，QC未能完全将pcDNA包裹，还有微量的pcDNA混合后，差异和显著差异这就说明这两个质量浓度的变化对人。出孔；QC和pcDNA以质量比5：1QC能完全。胚肾T细胞来说有质的影响而聚乙烯亚胺在01g／L时．将pcDNA包裹，pcDNA完全被阻滞在加样孔中，10g／L已经造成大部分细胞的死亡，：1151g／L的壳聚糖季铵盐对。琼脂糖凝胶电泳结果分析见图2。细胞的毒性还要大25．，进而说明壳聚糖季铵盐的低毒性72h后达到最强荧光观察及转染效率，转染细胞24h后出现零星，的绿色荧光48h后增强，见图46。Laconeshitofc1：NakedpcDNA31EGFP；Lane2：Quaternaryaman／1)：Lane3：QuaternarypcDNAnanopa~icles(2：一．moniumsaltofammoniumammonrnarysaltsa1)：Lane4：Quaternary(5：altofchitosan／1)：Lane5：QuatepcDNAnanoparticles(10：cDNAnaommoniumsaltofchitosan／n1)pparticlesf20：annanohitos／pcDNAparticlesiumFigure2图2yofquaternaryammoniumsaltofchitosanpcDNA31EGFP0000000004G3FP3266DNA34441E壳聚糖季铵盐pc纳米粒凝胶阻滞电泳图28075ereassa一．—GItardation一。．093123．DNase如如如蜘如加如曲如0000O000D2534I的保护实3验34对照裸pcDNA11，经DNase，I作用完全被酶解，而包裹TQC的pcDNA~j保持完好．并且完全阻滞在加样孔中效地防JLpcDNA被DNa泳结果分析见图3。，说明QCpcDNA纳米粒能有—seI降解。10g／L琼脂糖凝胶电图4结果显示显著差异，293T细胞在牛血清存在的条件下转，染的效率明显地高于无血清存在的条件。统计学上有极当壳聚糖季铵盐和质粒形成的纳米粒对细胞，的转染效率都明显高于裸质粒的质量比为5Lane，当壳聚糖季铵盐和质粒10，20形成的纳米粒对细胞的转染效率1：NakedpcDNA31EGFP；La．一ne2a：Nakedammon~HPEI无显著差异iumsa。pcDNA31EGFPDNasel：Lane3：Quchitosan／1)：LapcDNAnanoparticles(2：．+ternary4ltofsane：Quaternaryammoniumuaternary‘ltofchitosan／pcsaDNAltonanoparticlesc(2：1)DNa+seI：LasammoniumfhitosanQuatenanocrnaryammoniumsa／pcDNAnaltofchitosaternarynoparticlene5：Q1)：Lane6(5：n，DcDNAnanosapa~icles1)+DNa(5：sef：Lane7：Quaammoniumltofcsahitosltoan／pcDNAparticlessan1)：La(10：nanone8：Quaternayrammoniumfhito／pcDNA11+DNaseIpa~iclesf10：Figure3AgarosegelnelectrophoresisresultsofDNase图3pDNasrotectioje的保护实验中琼脂糖电泳结果1A，2moun5tofpDNA1024．壳聚糖季铵盐的细胞毒性检测采用MTT法测定(ug)samemassFigure5Trawnsn一fectionefimassciencra，yo测得不同壳聚糖季铵盐浓度作用24h~293T细胞的月值见表1。hethetiois2fpDNAintheor5图5在同质粒质量不同质量比条件下形成的纳米粒|SSN16738225—CN211539／R—CODEN：ZLKHAH2375钟螭．等壳聚糖季铵盐{乍为基因递送载体的初步研究。一一图5结果显示其中两个转染效率比较好的组合是：当0器^。亡∞l。E0亡。写2∞亡仍Jl本文中提到的壳聚糖季铵盐是以CTA为改性剂制备得到的能多，质粒质量为2的时候时，，ug时，壳聚糖季铵盐和质粒的质量比为5。∞5；∞加∞∞加∞加佃由于CTA是一种比较廉价的原料，相信成本的降转染的效率达到3943％；当质粒质量为5，ug低会使壳聚糖季铵盐在各个领域的大规模应用成为可。壳聚糖季铵盐和质粒的质量比同样为5的时候．转染J3853％的效率达~1。在本实验整个转染的过程中，，影响转染的因素有很Ⅲ如转染液的pH值、纳米粒的粒径大小掣J。对于牛豳QC■cs血清在转染过程中是否对转染效率产生影响，每位学者的意见也不尽相同。考虑到每一种载体材料和细胞的特裸质粒的转染效率极低，性不尽相同效率的影响，所以本实验比较了牛血清存在与否对转染从图5可以看出，。，LFigureLfectionhitosane壳聚糖季铵盐和pcDNA以质量LC2分别为1956％。5，10，20结合形成的纳米粒在无血清转染的条件下对细胞的转染效率，4825％．，6911％．，6743％．，而在有血585％．清的条件下对细胞的转染效率分别为0_78％4723％．，，，3544％．，明显可以发现血清的存在会降低载基，6TraonsifciencyofcandCSnafquaternaryammoniumsaltnoparticlesincubatedwithout因纳米粒对细胞的转染效率可能是血清蛋白带负电荷的FBS图6壳聚糖和壳聚糖季铵盐纳米粒在无血清转染的条件下对293T细胞的转染效率缘故，当纳米粒遇到血清时会造成纳米粒的解副但是Tha，㈨J，并且在实验中发现加入了牛血清反而对细胞造成了更大的伤害图6结果显示壳聚糖和壳聚糖季铵盐在无血清转染的条件下对293T细胞的转染效率的比较在前三个比例，，nou等毕叫却认为血清对转染没有什么结合形成的纳米粒在细胞转染结合形成的纳米影响。另外在显微镜下可以观察到壳聚糖季铵盐和pcDNA以质量比为2或5中粒，壳聚糖季铵盐纳米粒的效率明显地高于壳聚糖纳米且呈显著性差异。的整个过程中对细胞的正常生长没有什么影响；而壳聚，而在最后一个比例中，，虽然图上糖季铵盐和pc亡DNA以质量比为10R20一显示是壳聚糖纳米粒转染效率更高但是由于细胞状态粒对细胞造成了。定的毒性，细胞出现了大面积的凋极差，故不作考虑。在流式检验中得出的转染率主要取决于所剩细胞中，取转染72h的人胚肾T细胞pcDNA~．，以未转染的人胚肾T细，被转染的细胞所占的比例所以壳聚糖季铵盐~I]pcDNA以质量比为10结合形成的纳米粒对细胞转染效率虽然胞作为荧光背景做流式细胞仪检测达4825％见图7以壳聚糖季铵盐和，质量比为5结合形成的纳米粒为例。。转染率高高于壳聚糖季铵盐和pcDNA以质量比为5结合形成的纳，米粒，但是考虑到前者所剩细胞不多且毒性大。因此综合分析得出：后者明显优于前者【’。。此外，阳性对照聚乙，烯亚胺的转染效率在流式检测中也显示出很高的效率，}Ij姓i矗≯～J1但是细胞毒性同样也是需要考虑的问题对纳米粒的摄取似乎和细胞膜的破坏有于今后研究纳米粒进入细胞的途径有一。实验提示细胞定关系，I0t≯。一’+≯√。而细胞膜的破坏就是阳离子多聚物的毒性所造成的I一。”，这对。卜『0Figure。。秽一0，’?一。一{】j定的参考意义，～ha。咿为了寻求本递送系统较优的转染条件察了基因递送的最佳量。本实验还考壳聚糖季铵7Expression293TcellsammOnium=dgreenfluorescentproteininaf【ertransfectedfor72hours『QuaternarysaltofchitosanpcDNAnanopa~iclesoennce—f由图8可以看出，盐和pcDNA以质量比为2结合形成的纳米粒随着基因量图7w5：1)](w／转染72h后293T细胞绿色荧光蛋白的表达w5：1)】fQCpcDNA纳米粒(w／—的增加10“，转染效率也在不断地提高，当pcDNA质量达到，=g的时候转染效率反而有所下降u这是因为壳聚糖季铵盐的量已经到了20显的凋亡3。g，细胞在一定程度上出现明而壳聚糖季铵盐和pcDNA以质量比为5结合u讨论目前很多壳聚糖的衍生物就是针对这个性质进行形成的纳米粒在pcDNA质量为2还是细胞状态都是最佳的，g时无论是转染效率，同时在成本上来说也是最经，济的。所以综上所述u，在这个基因载体递送系统中，选制备的，壳聚糖季铵盐就是其中之，一。壳聚糖季铵盐的[16_仃】。择pcDNA质量为2g壳聚糖季铵盐和pcDNA以质量，种类有很多2376因改性剂和制备方法的不同而不同比为5结合形成的纳米粒Po．在无血清条件下进行转染Shenyang110004cnz．，Box1200glck~com钟媾，等．壳聚糖季铵敖作为基因速送载体琦e物步研究震蝴7孑QinCXiaochitosanNgrowthofm12112610】ThanouM【oligomersa，——mGR难叻rg对293T细胞来说转染效率是最高的由此实验可以看出，。一壳聚糖季铵盐纳米粒能将基因，QLiHeta1Calorimetricstudiesoflheactionof2hydroxypropyltrimethylammOniumchlorideOnfheicroorganismsIntJBioIMacrom012004；：34(1-2、，，．一．．递送到细胞内研究疗中，并且能使基因在细胞内进行表达因此一壳聚糖季铵盐用做基因递送的载体系统是值得进。步定[12】当然，转染的效率还有待于提高，，期望能在一程度上提高基因转染的靶向性。特别是在肿瘤的基因治4参考文献ZhongJHong丫ChenY_ZhongguozuzhiGong1115_1118LinchuangKangfu2008；12f6)：，．．13】【BIGeldofMeta1QuaternizedchitosanlgenedeliveryvectorsinepithelialcellIinesBiomaterials2002；23(1)：153159ThanouMMKotzeAF，eclofdegreeofScharnnghausenTefalE目_fulrimeorenhancedatemzionOfNtthIisancathlorideaychtotransportofhydrophiliccrompoundsacossfncestinafcaco2celfmonolayersJControIRetease2000；64(131：1525CaiZSWangJTYangCSetalJingxiHuagong2004；21(9)655673蔡照胜王锦堂杨春生等2羟丙基三甲基氯化按壳聚糖的制备及其表征[J】精细化T200421(9)655673MaoHQRoyKTroungLeVLletaIChitosanDNAnanoparticlesasgenecarriers：synthesischaracterizationandtransfection70(3)：e币ciencyJControIRelease2001；399421．Floresa，．．nove—．，———．．，，．．一，，，—，，——，，．，．．14【c1hengYanjiuyu钟婧洪艳陈勇壳聚糖季铵盐的最新研究进展…中国组织工程与临11151118床康复200812(6)：MoriTOkumuraMMatsuuraMetalE~ctsofchitinandits，，．[15】—。，．，，ibroblastsderivativesontheproliferationandcytokineproductionoffinvitroBiomaterials1997Jul；18(13)：947951MumperRJWangJClaspelIJMetaINoveIpolymericcondensingcarriersforgenedeliveryProcIntlSympControlledRelBioactMater1995；22：178179FanJSChenGHSunMKeta1QingdaoHaiyangDaxueXuebao2002：32(2)：296300范金石陈国华孙民昆等壳聚糖特性粘度的快速测定【青岛海洋J】296300大学学报200232f2)：DNAselfassembleGao丫XuZChenSeta1Argininechitosan／nanoparticlesforgenedelivery：Invitrocharacteristicsandtransfectionef241246iciencyIntJPharm2008；359(12)：ZhangSXuYWangBetalCationiccompoundsusedinlipoplexesandpolyplexesforgenedeliveryJControlRelease2004；2100()：16518029(10)：XiaoLZhangJHuanjingyuJishu2006；3436—．．．16】【。．．．．．．．—．．17】【，．，．．—，．，．．f18】19]【，．．．—，，．—．．．，．．．[20】——，．．．肖玲张婧交联壳聚糖季铵盐与聚合铝复合的絮凝研究效果【J】l环境科3436学与技术200629(10)：7(1)：13LiMGeY丫WangTTSichuanHuagong2004；[李铭葛英勇王婷婷改性壳聚糖在化妆品中的应用研究【J]四川化：20047(1)：13，—，，．211【—，．．．，，．．，ticlesPtCorsiKetalChitosanDNAnanoparasnonviralvectorsingenetherapy：strategiestoimprovetransfectioneficacyEurJPharmBiopharm2004；57(11：18HammanJHKotzeAFE目_eclofthetypeofbaseandnumberofreactionstepsonthedegreeofquaternizationandmolecularweightofNtdmethylchitosanchlorideDrugDevIndPhaml2001：27(5)：373380MaoSShuaiXUngerFtetalSynthesischaracterizationandcytotoxicityofpoly(ethyleneglyc01)grafttrimethylchitosanblockcopolymersBiomaterials2005；26(32)：63436356MorganDMLarvinVLPearsonJLBiochemicaIcharaterizationofpolycationinducedcytotoxicitytohumanvascularendotheliafcellsJ94：5539CellSci1989；MaOHQRoyKTroungLeVLletaIChitosanDNAnanoparticlesasgenecarriers：synthesischaracterizationandtransfectJoniciencyJControIRelease2001；ef70(3)：399421MacLaughlinFCMumperRJWangJeta1Chitosananddepolymerizedchitosanoligomersascondensingcarriersforinvivo25927256(13)：yJControlRelease1998；plasmiddeliverThanouMMVerhoefJCRomeijnSGeta1EfectsofNtrimethylchitosanchlorideaco2intestinaIanovelabsorptionenhanceroncepitheliaandtheciliarybeatfrequencyofchickenembryofracheaIntJPharm1999；185(11：7382DaumNNeumeyerAWahlBeta1InvitrosystemsforstudyingepithelialtransportofmacromoleculesMethodsMolBi012009：480：151164MansouriS．Lavigne—．。．．．．，，，—．．．，—．—．，，．，．．．，，，．—．．．，．．—．，，，．．——．．lSSN16738225．RCN211539／．2009年皈权归《中国组织I程磺究与临来壤复》杂志社断袁SCI收录的NRR杂志近期出版方向0在体现神经再生的功能层面上：关，0如果您有这样的优秀研究成果本，注认知学习与记忆感觉整合与行为以及视觉环路的研究，。刊是您的最佳选择10杂志出版后、，您的文章将与NRR杂、、0在体现神经再生的技术层面上、：志一起被SCIBPCAEMSCOPUS、、关注基因工程0细胞工程、组织、工E等多家国际著名数据库收录优秀稿件需短时效出版“”，。((中国神经再生研究(英文版)》程相关技术以及神经干细胞组织用。神经0杂志将在每期出版的文章中最及时地反映脑结构与功能脊髓结构与功能周围神经结构与功能的最新研究成、工程技术在神经再生领域的应、设绿色特快通道栏目，本刊还开为抢首发权的作者提供优质服务10果o。在体现神经系统疾病的层面上、：、关注脑卒中帕金森病、、脑性瘫痪、在体现神经再生的组织结构层面上：关注神经细胞的分子及细胞生物学发育生物学神经形态学神经病理学神经影像神经电生理神经生化以及细胞培养的研究，，，，癫痫性变、肌无力硬化症，、脊髓损伤以及神经退行应用中医药干预神经系统疾病后神经元结构与功能微观变化的定性或定量研究。，，。|ssN16738225RCN211539，．coOEN：zLKHAH2377